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MTDH/AEG-1在肝癌靶向性肺转移中的作用和分子机制研究

周珍珍  
【摘要】:目的:肝癌是我国常见恶性肿瘤之一,早期容易发生侵袭转移,是其术后复发、疗效差的主要原因。肿瘤侵袭转移是多步骤的复杂过程,但肿瘤细胞向微血管内皮细胞定向趋化、肿瘤细胞骨架重排以及与微血管内皮细胞黏附、在靶器官组织中定植无疑是肿瘤发生侵袭转移的基础。本研究拟探讨MTDH/AEG-1通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol (-3) kinase,PI3K)信号通路在细胞形态改变和人肝癌细胞趋化、黏附中的作用及其机制。 方法:采用RT-PCR检测MTDH/AEG-1基因在20例原发性肝癌组织和对应癌旁组织中的表达;运用Western印迹法和免疫荧光法检测MTDH/AEG-1蛋白在肝癌细胞株中的表达;构建针对MTDH/AEG-1的真核表达和干扰载体,转染肝癌细胞株HepG2,获得稳定表达细胞株;全基因组表达谱芯片筛选MTDH/AEG-1可调控的肝癌侵袭转移相关的基因与信号通路;采用激光共聚焦显微镜观察MTDH/AEG-1对肝癌细胞形态和骨架的改变以及RhoA的活性的调控;趋化实验检测MTDH/AEG-1表达水平不同的肝癌细胞株向不同微血管内皮细胞的趋化;通过趋化实验检测MTDH/AEG-1对HepG2细胞向不同微血管内皮细胞趋化的能力以及CXCR4活性的调控,ELISA检测微血管内皮细胞CXCL12的分泌,并观察CXCR4特异抑制剂AMD3100和CXCR4特异配体CXCL12处理后HepG2的趋化能力的改变;通过黏附实验检测MTDH/AEG-1对HepG2与微血管内皮细胞黏附能力以及ICAM-1活性的调控;Western印迹法检测MTDH/AEG-1对HepG2细胞中细胞外调节信号激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)-1/2、p38 MAPK和P13K/p85磷酸化的影响。 结果:20例原发性肝癌组织中,18(90%)例癌组织检测到MTDH/AEG-1蛋白水平表达,癌组织中MTDH/AEG-1表达明显高于癌旁组织;MTDH/AEG-1在高转移潜能肝癌细胞株SK-Hep-1、MHCC-97H中表达明显高于中、低转移潜能HepG2、Huh7肝癌细胞株,表达部位主要在核周和胞浆;增强及抑制HepG2细胞MTDH/AEG-1表达后,全基因组表达谱芯片技术检测CXCR4、ICAM-1以及MAPK肿瘤转移相关基因和信号通路发生明显变化;MTDH/AEG-1过表达后ERK1/2、p38 MAPK和P13K/p85的磷酸化增加;MTDH/AEG-1高表达的Sk-hep-1、MHCC-97H细胞比低表达MTDH/AEG-1的细胞HU-H7、HepG2更易向肺微血管内皮细胞趋化(HPMECs) (p0.05);与人脐微血管内皮细胞(HUVECs)比肝癌细胞Sk-hep-1、MHCC-97H、HepG2更易向人肺微血管内皮细胞趋化(p0.05);增强及抑制HepG2细胞MTDH/AEG-1表达后,CXCR4的表达明显增加(减少),使HepG2向人肺微血管内皮细胞(HPMECs)趋化的能力增强(减弱)(P0.05), CXCR4特异抑制剂AMD3100使ERK1/2、p38 MAPK和P13K/p85的磷酸化减少,使MTDH/AEG-1诱导的HepG2细胞趋化作用减弱(p0.05), CXCR4特异配体CXCL12因子可增强MTDH/AEG-1诱导的HepG2细胞趋化作用(p0.05),它在HPMECs中的分泌高于人脐静脉内皮细胞(HUVECs)(p0.05),其唯一受体CXCR4在人肝癌组织及细胞株中基因高表达;增强及抑制HepG2细胞MTDH/AEG-1表达后,ICAM-1的表达明显增加(减少),使HepG2与人肺微血管内皮细胞(HPMECs)黏附能力增强(减弱)(p0.05),但RhoA的表达明显减少(增加),使HepG2细胞骨架重排聚集(分散)在细胞胞浆中;增强及抑制HepG2细胞MTDH/AEG-1表达后,273个基因表达上调1.5倍,156个基因表达下调1.5倍,而显著改变的基因(表达上调≥2倍或下调≤2倍)包括:上调基因SNCA, IL1B, IFI27, PTGS2, PFKFB3, C4BPA, IL6, KIAA1199, ITPR1, C8orf22, LMLN, IFI27, ISG20, CD109,COL3A1,NPTX1和下调基因DPYSL3, KRT19, FAM26F, SRGN。 结论:MTDH/AEG-1通过激活ERK1/2、p38 MAPK和P13K信号通路诱导CXCR4、ICAM-1、RhoA的表达从而调控肝癌细胞的定向趋化、黏附能力以及细胞骨架重排,进而参与肝癌的定向肺转移。


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