重组腺相关病毒介导NF-κB/p65 shRNA改善mdx小鼠肌肉病变的作用研究

【摘要】：研究目的 研究重组腺相关病毒携带NF-κB/p65 shRNA下调炎症通道在mdx小鼠肌肉退行性病变过程中的作用,为“一步法”实现抗炎和基因替代治疗杜兴氏肌营养不良综合症提供可行的依据。 实验方法 1.构建pAAV-D(+)-U6-NF-κB/p65 shRNA-CMV-ZsGreen质粒(以下简称为NF-κB/p65 shRNA质粒)。采用CsCl梯度离心法提取并纯化大量NF-κB/p65 shRNA-ZsGeen质粒和pAAV-D(+)-U6-control shRNA-ZsGreen质粒(以下简称为control shRNA质粒)。采用三质粒共转染方法制备AAV9-D(+)-U6-NF-κB/p65 shRNA-ZsGreen病毒(以下简称NF-κB/p65 shRNA病毒)和AAV9-D(+)-U6-control shRNA-ZsGreen病毒(以下简称control shRNA病毒),并纯化、测定病毒滴度。 2.脂质体转染法将NF-κB/p65 shRNA质粒和control shRNA质粒分别转染小鼠巨噬细胞(RAW细胞株),设立PBS对照组。48小时候在荧光显微镜下ZsGreen蓝色荧光蛋白的表达,以观察质粒转染和表达情况。收集细胞,Western blot检测各个组磷酸化NF-κB/p65蛋白水平的差异。 3.将实验动物按鼠龄分为年轻组(1个月)和年老组(4个月)。每个鼠龄按动物品种和干预条件又分为正常组(C57BL/6J小鼠,n=4)、实验组(mdx小鼠+NF-κB/p65 shRNA病毒,n=4)、实验对照组(mdx小鼠+control shRNA病毒,n=4)、实验空白组(mdx小鼠+PBS, n=4)。除正常组小鼠只接受50μl PBS注射之外,其余组别小鼠的右小腿腓肠肌接受50μ1一定滴度的病毒注射,左小腿腓肠肌同时接受50μl PBS溶液注射。1个月后,小鼠在CO2箱被处死。所有小鼠左、右腓肠肌被取材并行冰冻切片。直接荧光显微镜观察病毒在各个组小鼠体内表达差异以及肌肉细胞膜稳定性差异。qPCR和免疫组化染色检测各个组小鼠肌肉磷酸化NF-κB/p65水平。HE染色比较各个组小鼠肌肉形态学变化并比较中央型细胞核的肌纤维比例。Masson Trichrome染色比较各个组肌肉纤维化情况,免疫组化染色mIgG和eMyHC蛋白来比较小鼠肌肉坏死和肌纤维再生在各个组的差异。 实验结果 1.成功构建NF-κB/p65 shRNA质粒并制备相应的高纯度的血清9型腺相关病毒。 2. Western blot检验结果表明NF-κB/p65 shRNA能在炎症刺激状态下降低小鼠巨噬细胞磷酸化NF-κB/p65的蛋白水平,减轻炎症程度。 3.(1)HE染色结果显示实验组小鼠肌肉形态学改善,肌肉的炎性细胞更少,形态学表现更接近于正常组。而实验对照组和实验空白组有大量的炎性细胞聚集、筋膜增厚、肌肉坏死和脂肪细胞取代等现象。 (2)定量统计中央型细胞核肌纤维数目并进行比较,结果发现在年轻组中,实验组小鼠中央型细胞核肌纤维数目低于实验对照组和实验空白组,说明NF-κB/p65 shRNA能减少mdx小鼠肌肉退变,延缓其病变过程。但在年老组该数据不同组间无明显差异。 (3) qPCR结果表明,和实验对照组相比,实验组的磷酸化NF-κB/p65 mRNA水平显著性下降。免疫组化结果证实磷酸化p65阳性的肌纤维数量显著性减少,体内炎症水平明显减轻。 (4)小鼠IgG免疫组化染色结果证明实验组小鼠肌肉坏死情况明显改善,优于实验对照组和实验空白组。这一差异在年轻小鼠组尤为明显。 (5)胚胎肌重链蛋白eMyHC免疫组化染色结果表明NF-KB/p65 shRNA能减少年轻组mdx小鼠肌肉的再生,延缓其肌肉干细胞的消耗进度,从而提高年老组mdx小鼠肌纤维再生能力。 (6)实验组mdx小鼠肌纤维Evans Blue染料渗透的面积小于实验对照组和实验空白组,证实NF-κB/p65 shRNA能提高mdx小鼠肌肉细胞膜的完整性。 实验结论 重组腺相关病毒介导的NF-κB/p65 shRNA能明显降低mdx小鼠肌肉的炎症程度,改善肌肉形态学结构,减少肌肉坏死和肌肉纤维化,延缓年轻mdx小鼠肌肉退变过程,提高年老mdx小鼠肌肉再生能力和肌纤维细胞膜完整性。能为抗炎治疗同时行基因替代治疗“一步法”方案提供可行性的依据。

【关键词】：重组腺相关病毒 NF-κB/p65 shRNA mdx小鼠 基因治疗
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R685
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