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《华中科技大学》 2012年
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表皮干细胞在不同外界因素下对其生物学特性的影响及机制研究

尹德龙  
【摘要】:第一部分 表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定 目的体外分离培养表皮干细胞,并对所取表皮干细胞进行形态学,特异标志物进行检测,以确保所取细胞为表皮干细胞。 方法根据之前研究者的体外培养的表皮干细胞方法进行综合,并成功提取出表皮干细胞,进行体外培养,选取表皮干细胞特定的表面标记物CK19,整合素β1运用免疫荧光染色鉴定,并对细胞进行整合素a6和CD71双染色通过流式细胞仪检测,鉴定所取的细胞为表皮干细胞。 结果根据倒置相差显微镜所得细胞形态,免疫荧光检测结果显示所取细胞CK19及整合素p1阳性,及流式细胞仪检测指标结果所取细胞整合素a6阳性,CD71阴性。 结论体外成功分离培养出表皮干细胞。 第二部分 不同频率低强度电磁场对表皮干细胞beta-catenin, Myc基因的影响 目的观察表皮干细胞的增殖、分化相关基因myc, beta-catenin在低频电磁场中的变化。 方法从大鼠背部皮肤处分离的第2代表皮干细胞(EpiSC)分为实验组和对照组,实验组又根据低强度磁场频率不同分为15,50,75Hz组。将各组细胞进行形态学观察,免疫荧光染色检测,RT-PCR检测相关基因的表达变化,免疫组化鉴定细胞的相关蛋白表达情况。 结果表皮干细胞在受到低强度磁场刺激后myc,β-catenin与对照组比有显著差异(P0.01),且不同频率下存在差异,50Hz75Hz15Hz(P0.05)。 结论低强度脉冲电磁场能促进表皮干细胞分化,不同频率刺激效果不同。 第三部分 Nanog和β-catenin对表皮干细胞增殖、分化中新的调控点 目的明确在表皮干细胞的增殖和分化的过程中Nanog通路和wnt/β-catenin通路是否存在内在联系。 方法本实验从大鼠背部皮肤处分离的第2代表皮干细胞(EpiSC)分为实验组和对照组,将各组细胞进行形态学观察,免疫荧光染色检测,用MTT法测定表皮干细胞的增殖,免疫组化鉴定细胞的相关蛋白整合素β-1及CK15表达情况。Western Blotting、PCR测定β-catenin和Nanog含量水平的变化。 结果MTT法检测到10-7M SP显著促进EpSCs的增殖,且EpSCs仍保持其干细胞性。Western Blotting检测到β-catenin和Nanog蛋白在最初24小时少量表达, Nanog蛋白水平在24h后显著表达并持续72h,72h后明显下降。而β-catenin蛋白水平在整个过程中持续升高。PCR检测到Nanog mRNA在整个过程中表达降低,β-catenin mRNA和Myc mRNA在整个增殖过程中持续高表达。 结论实验表明10-7M神经肽SP物质可有效的刺激表皮干细胞的增殖,表明Nanog通路和wnt/β-catenin通路的可能存在联系。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R329

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