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《华中科技大学》 2012年
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TLR/MYD88/NF-κB信号通路阻断对减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤的作用研究

薛承彪  
【摘要】:第一部分T细胞特异性NF-κB活化抑制较非特异性NF-κB抑制能更好的减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤 [目的]研究非特异性NF-κB抑制剂-UA对减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用,并比较T细胞特异性NF-κB活化抑制与非特异性NF-κB抑制对小鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护影响差异。 [方法]将雄性C57BL/6小鼠分为4组,其中一组为C57BL/6背景IkBΔN-Tg小鼠,每组8只。假手术组(SO)小鼠接受中线开腹、左侧肾缔游离,右肾切除及关腹操作;溶媒对照组(CMC组)以等体积的CMC灌胃;熊果酸处理组于肾脏缺血前-2,-1,0,1天0.5%羧甲基纤维素(CMC)溶解熊果酸,以10mg/kg灌胃并行中线开腹、左侧肾缔游离哈巴狗阻断60min后开放,右肾切除及关腹;IkBΔN-Tg组同上述操作行IRI。各组通过检查再灌注损伤后24h,3d,7d检测各组血清尿素氮(BUN)和肌酐(CR)水平,30天生存率观察等评价熊果酸对肾脏IRI的保护作用。HE染色观察肾脏组织形态学变化,TUNEL法检测各组肾小管上皮细胞凋亡情况,MPO免疫组化染色检测肾脏组织内巨噬细胞、中性粒细胞的浸润,TransF actor比色法检测各组肾脏组织中NF-κB激活水平,real-time PCR检测NF-κB下游炎性因子IL-1β,IL-6,TNF-α的表达水平,DCFH-DA荧光探针检测肾组织中活性氧(ROS)的产生。 [结果]与溶媒对照组相比,UA处理组和IkBΔN-Tg组24h血清BUN, Cr水平明显降低(BUN 34.09±4.71612.79±2.194 vs 72.63±9.216,p0.01 p0.01;sCr 60.67±12.61 27.33±6.31 vs 150.3±14.5,p0.01 p0.01)。肾小管上皮细胞损伤情况较轻,肾小管上皮细胞凋亡减轻,肾脏组织内巨噬细胞及中性粒细胞浸润减少,NF-κB激活减轻(0.18±0.05 0.14±0.02 vs 0.36±0.06,p=0.0035 p=0.0005),IL.1β,IL-6,TNF-α表达下调(IL-1p 1.60±0.15 1.37±0.15 vs 3.80±0.40,p=0.0009,p=0.0006;IL-6 1.37±0.150.72±0.2 vs 3.57±0.65,p=0.0004,p=0.0002;TNF-α1.70±0.10 0.97±0.58 vs 2.40±0.26,p=0.0128,p=0.0008),ROS产生减少(4.6±0.36,4.6±0.50 vs 10.07±0.9,p=0.0006,p=0.0008)。UA处理组和IkBΔN-Tg组30天生存率结果显示将对照组生存率从12.5%分别提高到62.5%和75%. [结论]熊果酸通过抑制NF-κB激活,下调炎性因子IL-1β,IL-6,TNF-α的表达,抑制肾脏IR时ROS的产生,从而减少炎性细胞浸润,减少细胞的坏死和凋亡,有效保护小鼠肾脏缺血再灌注损伤,提高生存率。T细胞特异性NF-κB抑制较非特异性NF-κB抑制能更好的减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤。 第二部分MyD88抑制联合CD154-CD40T细胞共刺激信号通路阻断减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤的实验研究 [目的]探讨TLR/MyD88信号抑制联合CD154-CD40T细胞共刺激信号通路阻断减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤,并研究其机制。 [方法]以雄性BALB/C小鼠为实验对象,实验分为6组:SHAM组,缺血损伤IRI组,MR1组,TJ-2组,MYD88KO组和TJ-2+MR1联合用药组,功能试验各组6只,生存率观察各组8只。TJ-2用药组于肾脏缺血前-2,-1,0,1天0.5%羧甲基纤维素(CMC)溶解TJ-2,以100mg/kg腹腔注射并行IRI,即中线开腹、32℃左侧肾缔游离哈巴狗阻断80min后开放,右肾切除及关腹。MRl用药组则于肾脏缺血前-2,-1,0,1天给予0.25mg/次/只,对照组则给予等量的生理盐水并行上述操作。各组再灌注24h,3d,7d分别取外周血及左肾。测定血清肌酐(sCr)和尿素氮(BUN)水平。观察各组生存率。ELISA检测各组24h炎性因子IL-1β, IL-6, TNF-a及IL-10水平。EMSA检测各组24h时点NF-κB活化水平,DCFH-DA荧光探针检测肾IRI后24h ROS产生水平,HE,MPO,TUNEL免疫组化检测组织病理损伤,炎性细胞浸润程度,细胞坏死凋亡水平。 [结果]TJ-2组和TJ-2+MR1组能显著提高小鼠肾脏严重IRI后生存率(从12.5%到57.1%和100%)。肾功能结果显示两组小鼠24h血清BUN分别为47.2±9.5mmol/L, 20.4±5.2 mmol/L较CMC组56.7±8.3mmol/L降低,后者具有统计学差异p0.01;血清Cr分别为102.3±21.6μmol/L,51.2±8.9μmol/L,对比CMC组190.6±12.4μmol/L显著降低,并具有统计学差异p0.05,p0.01。细胞因子水平TJ-2组和TJ-2+MR1组对比CMC组显著降低IL-1β(36.23±11.0426.77±7.61 vs 97.65±15.06,p0.05,p0.01)IL-6(123.7±19.66 103.5±35.99 vs 630.3±61.8,p0.01,p0.01)TNF-α(29.57±4.89 21.27±8.72 vs 114.2±8.27,p0.01,p0.01);但IL-10表达水平升高(518.7±55.01 588.5±57.2 vs 230.3±61.8,p0.01,p0.01);ROS产生减少(5.16±1.2 4.17±0.81 vs 10.3±2.06,p=0.0205,p=0.0087),NF-κB活化减低。HE病理显示肾小管细胞坏死,管型形成,出血等损伤TJ-2和TJ-2+MR1组相对较轻;且MPO阳性表达减少,提示炎性细胞浸润减少,TUNEL显示两组凋亡细胞较缺血组显著减少。 [结论]MYD88小分子抑制剂(TJ-2)能够显著减轻肾脏缺血再灌注损伤,联合MYD88抑制和CD154-CD40 T细胞共刺激信号通路的阻断(MR1)效果更佳。其机理主要通过减少ROS的产生,阻断TLR/MYD88/NF-κB信号通路,从而阻止核因子KB的激活,上调IL-10的表达,进而共同抑制下游炎性因子(IL-1p,IL-6,TNF-α)的表达和释放,减少细胞的坏死和凋亡,从而减轻肾脏缺血再灌注损伤,提高小鼠严重IRI时生存率。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R363

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