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双功能抗体融合蛋白IP10-scFv定向募集T淋巴细胞靶向治疗鼠脑恶性胶质瘤的研究

王旋  
【摘要】:近年来,越来越多的证据提示中枢神经系统并非免疫豁免区,有研究证实被激活的淋巴细胞可以穿过血脑屏障。这使针对胶质瘤的免疫辅助治疗成为可能。随着胶质瘤特异性抗原的鉴定和发现,脑胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)过继治疗成为最令人瞩目的生物治疗研究领域之一。但是,过激治疗在体内疗效欠佳的重要原因就是靶向募集到胶质瘤细胞部位的胶质瘤特异性CTL的数量有限,而且由于肿瘤免疫逃逸,到达肿瘤部位的CTL靶向性和生物活性受到较大抑制,难以高效地清除肿瘤细胞。因此,如何靶向募集足够量的胶质瘤特异性CTL到达胶质瘤细胞部位以及提高其在肿瘤局部靶向清除肿瘤细胞的生物活性是必须攻克的难关。我们的策略是依照经典的树突状细胞(DC)为抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC),与胶质瘤细胞裂解物共培养诱导足量的胶质瘤特异性CTL,同时构建能够和胶质瘤细胞表面抗原EGFRvⅢ结合的双功能抗体融合蛋白IP10-scFv,让胶质瘤细胞靶向获得高浓度IP-10,利用IP-10对T细胞的定向趋化和促进淋巴细胞活化增殖作用以及抗肿瘤作用,实现将过继的CTL细胞双重靶向富集至肿瘤细胞,并增强它们对肿瘤细胞杀伤活性的目的。这必将大大提高CTL在体内攻击肿瘤细胞的靶向性和有效性,为其将来临床应用迈出一大步。 第一章融合蛋白IP10-scFv的构建及表达 目的建立一种快速有效的方法构建细胞因子融合蛋白IP10-scFv,并检测其在细胞株NIH3T3中的表达,筛选出稳定表达融合蛋白的阳性克隆株。方法通过RT-PCR法扩增小鼠IP10基因,全基因人工合成EGFRvⅢScFv,两段目的基因依次克隆于表达载体pcDNA3.1(-)PCMV启动子下游,二者以编码(Gly4Ser)3的柔性接头序列(1inker)相连。将构建好的pcDNA3.1(-)-IP10-EGFRvⅢscFv转染NIH3T3细胞,并用G418筛选出阳性克隆,采用实时定量PCR和Western-blot法检测克隆细胞目的基因和蛋白的表达量,并观察转染后的NIH3T3细胞体外生长状况。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-IP10-scFv,经过浓度为200mg/L的G418工作液筛选出了稳定高表达IP10-scFv的细胞系NIH3T3且其生长状态并未受转染基因的影响。通过荧光检测、实时定量PCR、Western-blot法检测到转染72小时后目的基因和蛋白表达量最高,和稳定克隆株相比,表达量并无明显差异(P0.05)结论构建的新型细胞因子融合蛋白可以在NIH3T3细胞内获得稳定表达,为后期融合蛋白的提取及功能研究打下基础。 第二章融合蛋白IP10-scFv的大量制备及其体外功能研究 目的利用PET高效原核表达系统,并利用体外复性技术,大量制备有活性的融合蛋白,为功能研究和体内研究奠定基础。方法利用限制性核酸内切酶将目的基因IP10-scFv从真核表达载体上切下后连入原核表达载体PET30a的T7启动子下游,在IPTG的诱导下高效表达重组蛋白。通过His-Tag标签镍磁珠纯化蛋白后进行透析复性,并在透析液中加入GSSG/GSH氧化还原系统,提高复性得率。将复性后的蛋白进行体外功能试验,包括ELISA、体外趋化、抗原抗体结合试验,验证其趋化性和特异性的结合能力。结果通过PET高效表达系统,我们得到大量的融合蛋白(包涵体表达),成功运用体外透析复性技术制备了具有功能活性的重组蛋白,经过ELISA检测结合力(affinity constant)KD值为1.32±0.05×10-8M,趋化试验检测IP10-EGFRvⅢ ScFv复性蛋白与IP10的趋化作用相当(P>0.05),免疫荧光和流式检测结合率为68.6%。结论IP10-scFv融合蛋白能特异性识别EGFRvⅢ抗原,且具备IP10的趋化功能。 第三章融合蛋白IP10-scFv联合CTL的体内研究 目的通过体外透析复性技术得到的具有功能性的融合蛋白,经过体外试验验证具有特异性的抗原抗体结合能力和CD8+T淋巴细胞趋化能力后,转入动物体内进一步研究抗肿瘤作用。方法体外诱导胶质瘤抗原特异性的DC细胞,并与CD8+T淋巴细胞混合培养,制备胶质瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞CTL,通过小鼠尾静脉注射与颅内注射IP10-scFv融合蛋白协同作用,观察荷瘤鼠生存时间及肿瘤体积的大小变化,并通过流式细胞术定量检测淋巴细胞浸润肿瘤组织的程度和持续时间;PI/Annexin V双染检测肿瘤细胞的凋亡。同时,通过活体成像检测IP10-scFv融合蛋白对淋巴细胞的趋化作用时间和趋化效果。结果通过DC混合培养技术成功制备出胶质瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞CTL,且在IP10-scFv融合蛋白的趋化作用下,能透过血脑屏障,富集在肿瘤组织周围,持续时间超过一周,与单用IP10-scFv融合蛋白仅调动自身体内的有限的肿瘤特异性杀伤细胞CTL相比,能明显缩小肿瘤体积,加速肿瘤细胞的凋亡,延长荷瘤鼠的生存时间。通过体内活体成像技术,经IP10-scFv融合蛋白趋化的CTL在第3-5天达到富集的最高浓度,1周后逐渐下降。结论经过原核表达,透析复兴技术得到的功能性融合蛋白IP10-scFv联合体外诱导混合培养的胶质瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞CTL具有强大的抗肿瘤效应,并且其体内浸润的时间可持续近1周。


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