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《华中科技大学》 2013年
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控制性叶酸剥夺法诱导小鼠iPS细胞的研究

闫秋月  
【摘要】:第一部分MEF细胞叶酸剥夺培养体系体外培养的研究 目的研究在叶酸剥夺条件下,小鼠胚胎成纤维(mouse embryonic fibroblast,MEF)细胞体外培养时重编程相关的多能性基因表达情况,了解叶酸是否参与细胞重编程过程。 方法分别用叶酸剥夺培养基和含正常浓度叶酸的培养基培养MEF细胞,分别在第3,6,9天比较两者在多能性基因的甲基化状态和多能性基因表达方面的变化。 结果叶酸剥夺培养条件下,MEF细胞的多能性基因(Oct4和Nanog)启动子区发生去甲基化,相应的多能性基因表达增加。 结论叶酸缺乏可促进细胞多能性基因Oct4和Nanog的表达,叶酸参与细胞的重编程过程,叶酸缺乏有利于细胞重编程的进行。 第二部分叶酸剥夺条件下四因子重编程MEF细胞为iPS细胞的研究 目的研究叶酸剥夺条件下利用4因子诱导小鼠多潜能干(induced pluripotent stem, iPS)细胞的诱导效率,优化iPS细胞诱导体系。 方法1)根据第一部分的结果,叶酸剥夺条件下培养小鼠胚胎成纤维(mouse embryonic fibroblast, MEF)细胞3天作为实验组;同时用含叶酸培养基培养MEF细胞3天作为对照组。 2)然后利用经典4因子对两组细胞进行重编程,并对所得的诱导iPS细胞进行鉴定,两组诱导效率进行比较;及对实验组获得的iPS细胞进行核型分析。 结果叶酸剥夺条件下培养的MEF细胞,经典4因子诱导体系的诱导效率较对照组提高5倍(0.05%vs0.01%),获得的iPS细胞保持未分化状态,多能性标记物检测均为阳性,核型分析结果示正常细胞核型。 结论本实验证明了叶酸剥夺法可在不增加致癌性的前提下提高小鼠iPS细胞的诱导效率,为将来的iPS细胞的研究奠定了基础。 第三部分叶酸剥夺条件下三因子诱导小鼠iPS细胞的研究 目的叶酸剥夺条件下,利用三因子进行小鼠iPS细胞的诱导,减少致癌因子,优化iPS细胞的诱导体系。 方法1)叶酸剥夺条件下培养3天的小鼠胚胎成纤维(mouse embryonic fibroblast, MEF)细胞作为实验组;同时以含叶酸培养基培养3天的MEF细胞作为对照组: 2)以两组细胞为靶细胞,利用Oct4, Klf4和Sox2三种因子进行iPS细胞诱导,并对诱导获得的iPS细胞进行鉴定。 结果叶酸剥夺培养后的MEF细胞经诱导可获得iPS细胞,诱导效率约为0.01%,并对其鉴定结果示其AP, Oct4, SSEA-1染色呈阳性,且可分化为三个胚层的体细胞。 结论叶酸剥夺诱导体系可成功替代癌基因c-Myc的使用,降低诱导过程中的致癌性。为提高iPS细胞的安全性打下基础。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R741.02

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