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《华中科技大学》 2013年
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肿瘤血管内皮细胞与骨髓间充质干细胞肿瘤归巢相关性研究

纪腾  
【摘要】:目的分离培养鉴定乳腺癌血管内皮细胞及与之配对的正常乳腺组织血管内皮细胞,并比较两者生物学性状差异 方法(1)取新鲜乳腺癌组织及正常乳腺组织,剪碎,胶原酶消化成单细胞悬液,细胞标记抗CD31单克隆抗体,免疫磁柱分离抗CD31单克隆抗体阳性细胞,即血管内皮细胞,并且体外原代培养,显微镜观察细胞形态。(2)流式细胞仪检测血管内皮细胞标志性分子CD31、CD34、CD105及vWF。(3)实时荧光定量技术检测正常组织血管内皮细胞及肿瘤血管内皮细胞基因表达差异。(4)体外血管生成模型验证两种内皮细胞的成管能力。 结果(1)免疫磁珠可以分离得到的高纯度的肿瘤血管内皮细胞及正常血管内皮细胞,两者存在形态学差异。(2)与正常血管内皮细胞相比,肿瘤血管内皮细胞高表达特异性的分子标志:肿瘤血管内皮细胞高表达肿瘤内皮标志1(Tumor endothelial markers, TEMs),肿瘤内皮标志1(TEM8),内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2),内皮生长因子受体(EGFR)以及乳腺癌血管内皮细胞所特有的标志HEYL和PRL-3。(3)肿瘤血管内皮细胞具有更强的体外血管形成能力。 结论免疫磁珠分选技术可以得到高纯度的内皮细胞,且两者存在形态学及生物学性状差异。 目的间充质干细胞是中胚层来源的具有多向分化潜能的干细胞,因其具有低免疫原性,肿瘤靶向归巢特性,以及其易于分离,扩增,可进行遗传修饰等优点,已成为最理想的基因治疗细胞载体。然而,目前研究对间充质干细胞肿瘤归巢的机制缺乏系统性的研究和深入认知。本文旨在探讨间充质干细胞靶向归巢与肿瘤血管内皮细胞的相关性。 方法(1) Transwell模型验证肿瘤组织及正常组织对间充质干细胞的体外迁移能力。(2)免疫荧光检测肿瘤组织及正常组织对间充质干细胞微管组织中心(MTOC)的影响。(3)胶原酶消化法及胰酶差异消化法获得肿瘤成纤维细胞,原代肿瘤细胞,Boyden小室比较不同细胞对间充质干细胞迁移能力影响。(4)鬼比环肽染色共培养的间充质干细胞,激光共聚焦观察细胞F-actin改变。 结果(1)与正常组织相比,肿瘤组织促进间充质干细胞的迁移能力更强。(2)间充质干细胞微管组织中心(MTOC)向肿瘤组织部位极性化,微管排列不规则,正常组织组观察到此现象。(3)来源于肿瘤组织的不同细胞中,肿瘤血管内皮细胞对间充质干细胞的去化能力更强。(4)与肿瘤血管内皮细胞共培养的间充质干细胞极性及细胞骨架发生明显变化。 结论肿瘤血管内皮细胞参与了间充质干细胞的肿瘤靶向归巢 目的作为理想的肿瘤基因治疗的细胞载体,间充质干细胞的肿瘤归巢是实现靶向治疗的关键环节及重要前提,明确间充质干细胞肿瘤归巢的分子本质对于其合理设计和应用肿瘤靶向治疗具有理论意义和指导价值。本研究在于从分子水平上探讨间充质干细胞靶向归巢的机制。 方法(1)细胞因子芯片高通量筛选参与间充质干细胞归巢的细胞因子。(2)ELISA检测肿瘤血管内皮细胞与间充质干细胞不同培养方式的IL6分泌量。(3)MTT方法检测IL6对细胞生长的影响。(4)Transwell模型验证IL6对间充质干细胞的体外迁移能力的影响。(5)鬼比环肽染色IL6处理的间充质干细胞,激光共聚焦观察细胞F-actin改变。(6)Western-blot检验IL6对间充质干细胞信号通路的改变。(7)利用Anti-IL6中和抗体封闭肿瘤内皮细胞分泌的IL6后,Transwell模型检验其对间充质干细胞的迁移能力的影响。(8)SiRNA干扰技术反义封闭肿瘤内皮细胞的IL6表达,Transwell模型检验其对间充质干细胞迁移能力的改变。(9)细胞体外标记并流式细胞仪鉴定标记效率后,利用小鼠耳朵模型体内验证IL6对间充质干细胞归巢的影响。 结果(1)细胞因子芯片发现肿瘤血管内皮细胞与间充质干细胞共培养的白介素-6蛋白表达峰度相对于肿瘤血管内皮细胞的表达峰度增高3.6倍,相对于间充质干细胞的蛋白表达峰度升高8.92倍。(2)ELISA检测发现,肿瘤血管内皮细胞与间充质干细胞共培养上清中IL6显著升高,验证了细胞因子芯片的结果。(3)MTT检验发现白介素6并未明显促进间充质干细胞增殖。(4)人重组IL6蛋白处理的间充质干细胞的体外迁移能力明显增强,结晶紫染色间充质干细胞穿膜细胞数明显增多,且存在剂量和时间依赖性。(5)激光共聚焦显微镜发现:10ng/ml IL6处理的间充质干细胞极性及细胞骨架发生明显变化,肌动蛋白变粗变大,并出现伪足结构。(6) Western-blot结果表明人重组IL6蛋白可以导致间充质干细胞内STAT3磷酸化,并上调与细胞运动密切相关的蛋白MMP3, MMP9。(7)Anti-IL6中和抗体可以有效的阻碍间充质干细胞的穿膜能力。(8) Western-blot结果表明IL6/SiRNA可有效抑制间充质干细胞内靶蛋白IL6的表达,抑制STAT3的活化,并且明显降低了间充质干细胞的体外迁移能力。(9)DiO及CellTrackerTM dye对内皮细胞及间充质干细胞的标记效率分别为96.53±3.21%,98.71±4.67%,且标记时间可长达3周。(10)小鼠耳朵模型从体内验证了IL6为间充质干细胞靶向归巢的重要分子机制。 结论IL6/STAT3信号通路可能参与了间充质干细胞的肿瘤靶向归巢
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R737.9

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