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基于固相增菌法和纳米生物传感技术的沙门氏菌可视化高效检测技术的研究

唐锋  
【摘要】:[目的]食源性致病菌(尤其是沙门氏菌)是公共卫生的严重危害。全球食源性疾病监测网(Global Salm-Surv, GSS)估算每年有9,400万非伤寒沙门氏菌感染者,并引发155,000人死亡。由于现有检测和分离技术的灵敏度不足,更多野生株并没有被充分检出,导致公众的实际感染率远大于当前的检出报道。沙门氏菌等食源性致病菌的感染剂量通常很低,目前亟待研制出更高灵敏度、检出率及分离率的适宜技术。虽然关于“一步法”和“快速检测法”的技术革新层出不穷,最大的技术需求仍要围绕实现靶向菌的分离,这将直接影响后续病原学诊断、分子流行病学分析和药敏检测的开展。实际上,真正有效的检测、分离技术应该基于充分的采样和增菌策略,并配合新颖的超敏生物技术(例如生物传感技术、免疫检测技术、纳米技术)。此前,应用荧光纳米生物技术实现可视化检测和原位分离细菌一直是个难题。本研究则拟设计一种新颖的基于特制纤维拭子固相增菌系统的荧光纳米生物检测技术,以实现沙门氏菌的高效检测和可视化分离,并期望进一步研制出更简便和低成本的固相增菌检测技术,以满足公共卫生监测中大样本量沙门氏菌筛查工作的需求。[方法]1.沙门氏菌固相增菌法的建立(1).拭子及应用培养基的研制:根据产硫化氢反应特性,本研究设计了能在拭子上将其转化成硫化亚铁黑色沉淀物的培养基反应体系,实现拭子上的沙门氏菌菌落示踪。本研究应用响应面法(response surface methodology, RSM)的中心组合试验设计(Central Composite Design, CCD)优化研究方案中的培养基示踪反应体系的成分。在优化研究中,以分属不同血清群(A-F群)的9株标准沙门氏菌株和不同血清型的40株地方菌株为代表样本各形成一个二阶多项式模型。(2).方法学评估:根据美国微生物学会(American Society for Microbiology, ASM)的Cumitechs指南(Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology),配制含沙门氏菌(101 cells ml-1)和大肠杆菌(104 cells ml-1、105 cells ml-1、106 cells ml-1、 107 cells ml-1)的模拟菌液,形成不同的实验组(每组40份),计算最低检出限、灵敏度、假阴性率、特异性及假阳性率等指标。由多家疾控中心共采集668份健康体检人群的肛拭样本,比较本研究方法与传统标准方法的阳性检出率差异。2.基于固相增菌法和纳米生物传感技术的沙门氏菌可视化高效检测技术(1).抗体制备:用分属不同血清群的8株标准菌株分别免疫2只SPF级日本大耳实验兔(共16只),提取并纯化抗体供实验研究阶段用。(2).探针标记:采用双功能交联剂法,合成抗体螯合的水溶性氨基功能化(CdSe/ZnS)量子点探针,并检测其表征及浓度等。(3).光学观测仪器及检测流程的研制:应用InGaN材料制作的156个蓝色发光二极管(激发波长为405nm)制成环形激发光源,配置10瓦的调谐器(输入电压:90V-264V,输出电压:12V)。此外,配套制作滤光片(国标编号:ZWB2),其大小恰好可紧扣于环形激发光源的正面,使波长400~680nm之间的激发光和其它干涉光得到截止。将滤光片与激发光源的组合体设法加装于体视显微镜的目镜上,构建适合于人工观测荧光及相关操作的仪器。配合探针及仪器的应用,开展检测及分离技术流程的探索。(4).表征的检测:应用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy, TEM)检测拭子纤维上生长的沙门氏菌菌体表面与量子点颗粒相互关系的表征状态。由紫外可见分光光度计检测量子点标记前后的紫外吸收光谱,并由荧光分光光度计检测相关荧光光谱。应用型场发射扫描电子显微镜评估拭子纤维上的沙门氏菌与探针间的生物构象和相互作用关系。(5).方法学评估:根据美国微生物学会的Cumitechs方法学评价指南,配制含101 cells ml-1沙门氏菌和105 cells ml-1、106 cells ml-1、107 cells ml-1非沙门氏菌(大肠杆菌/变形杆菌/柠檬酸杆菌)的模拟菌液(每40份样本为一组),计算其最低检出限。由疾控体检中心采集120份健康体检人群(未感染沙门菌)的肛拭液,再将定量的鼠伤寒沙门氏菌(101 cells ml-1)相应地加入模拟阳性的实验组,以检测灵敏度、特异性、检出率及工作效率等指标。3.基于固相薄膜增菌法的高效筛查和分离沙门氏菌的可视化检测技术(1).固相增菌用薄膜、简易紫外LED光源及本章相应的沙门氏菌可视化检测技术的研制。两种应用于固相薄膜上的生化显色功能化反应被研制。一种是基于沙门氏菌还原硫离子的特性;而另一种源于沙门氏菌特异性产生的C8辛脂酶可分解底物4-甲基伞形酮辛酯(MUCAP)试剂,分解转化成的4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone,4-MU)可产生肉眼可视的荧光(λex=365nm,λcm=450nm)。(2).方法学评估:应用115株标准或地方菌株,进行菌种特异性鉴定。由疾控中心共采集1304份健康从业人员的肛拭样本,其中80份加入定量101 cells ml-1的伤寒沙门氏菌(ATCC 14028),用于检测方法的特异性:余下1,224例新鲜肛拭样本则被用于比较本检测方法与传统方法的检出率等实用性能。[结果]1.沙门氏菌固相增菌法的建立(1).拭子及应用培养基的研制:拭子由0.1lg医用级100%脱脂棉纤维及14.5cm长的竹柄构成,能饱和吸取600μl培养基或样本液。培养基基础配方含“40μl 10%多价胨、40μ1 10%缓冲胨水、8μl 1%脱氧胆酸钠及0.01μg 高分子超速吸水树脂(Super-speed Super Absorbing Polymer, SSAP) ".设计的示踪反应体系三大变量被确定为“10%柠檬酸铁铵6μl,20%硫代硫酸钠6μ1,5%胱氨酸6μl"。以20%的碳酸钠调节PH值至7.2,并加入蒸馏水补至600μl总体积。RSM构建的Y1模型P10.0001、Y2模型P2=0.0002,均说明模型和优化方案有统计学意义。(医用脱脂棉纤维材料的最新行业标准:YY/T 0330-2015)。(2).方法学评估:当背景干扰菌(大肠杆菌)的浓度为105 cells ml-1时,本研究方法的沙门氏菌最低检出限为101 cells ml-1.根据美国微生物学会的Cumitechs方法学评价指南,本研究方法的灵敏度为98.75%,假阴性率为1.25%;在含大肠杆菌(105 cells ml-1)的模拟样本组中,本章方法的特异性为100%,假阳性率则为0.0%。在668份健康体检人群的肛拭样本的对比实验中,传统检测法的阳性检出率为为0.45%;而本法为2.10%,且24h内产黑斑率为67.66%(452/668)。2.基于固相增菌法和纳米生物传感技术的沙门氏菌可视化高效检测技术(1).抗体制备:所采集抗血清的效价均大于1:2048,后经蛋白层析法纯化得到的各(A-F血清群)抗体浓度分别为1.38mg/ml、1.42mg/ml、1.58mg/ml、1.07mg/ml、 1.52mg/ml、0.78mg/ml、1.58mg/ml、1.34mg/ml、肥达氏检测显示相应抗体对伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌及乙型副伤寒杆菌的凝集价介于1:2048-1:4096。(2).探针标记和评估:经琼脂糖凝胶电泳测试,单克隆抗体成功修饰量子点形成生物探针,且标记后纯化探针的浓度可达到98.6×10-2μg/μl。经透射电镜检测,探针的免疫学特异性被证实。经荧光分光光度计检测,探针的发射光谱最大波长在526nm,其与标记前的524nm波长非常接近,说明所采用探针标记方案对量子点性状的影响很小。(3).本研究方法及人工荧光观测仪被成功地研制。扫描电镜检测也确证了探针的特异性免疫反应性状。(4).方法学评估:当背景干扰菌(大肠杆菌/变形杆菌/柠檬酸杆菌)的浓度达到105 cellsm1-1时,本法的沙门氏菌最低检出限应为101 cells ml-1 。在加标(含101 cells ml-1鼠伤寒沙门氏菌)模拟样本中,本方法的阳性检出率为96.67%,而传统方法为91.67%。其中,硫化氢反应产黑斑率为100%,肉眼可识别荧光率为68.33%。在不加标模拟样本中,本研究方法的产黑斑率为25.00%(30/120),产荧光率(假阳性率)为1.67%(2/120)。在围绕硫化氢反应设计的筛选作用下,本研究方法的后续工作量被减少到25%(30/120)。在模拟样本中,本方法的特异性可达98.33%(118/120)。3.基于固相薄膜增菌法的高效筛查和分离沙门氏菌的可视化检测技术(1).应用三号层析滤纸薄膜成功制作含培养基的固相薄膜,每份纸片的尺寸可刚好饱和吸收1.0m1培养液。经过研制,基于沙门氏菌产硫化氢反应及MUCAP特异反应的固相薄膜增菌法被确定。(相关化学分析滤纸材料的国家标准号为GB/T 1914-2007)。(2).方法学评估:在115株菌的验证试验中,此可视化检测沙门氏菌技术的菌种特异性为94.78%(109/115)。在浓度为105 cells ml-1的大肠杆菌背景下,本章研究方法的沙门氏菌最低检出限可达101 cells ml-1。在80份加标(101 cells ml-1的伤寒沙门氏菌ATCC 14028)肛拭样本中,两步生化显色反应的阳性率均为100%。在肛拭样本的应用验证中,本研究方法的整体阳性检出率为2.45%(30/1224),而传统标准方法为0.49%(6/1224);双阳性反应的样本率为37.25%(456/1224);产硫化氢阳性且MUCAP阴性的单阳性样本率为17.40%(213/1224)。换言之,全部样本经筛查仅456份需要按照标准流程作后续分离鉴定。[结论]一种特异、高效、灵敏的可视化检测沙门氏菌的免疫传感技术和一种新颖、简便、低成本的可视化固相薄膜增菌检测法同时被建立。这些方法都可成为公共卫生监测和筛查大样本中沙门氏菌的有利工具。实际上,高效获取靶向菌的分离株是本技术的最大目的和优势,这将有助于进一步开展公共监测领域(如食物中毒和水污染)中的分子流行病学分析和临床上的病原学确证、药敏实验。此外,期待研制的层析薄膜增菌检测新技术能被成功应用到广大公共卫生监测领域,尤其在发展中国家获得推广。


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