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《华中科技大学》 2016年
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急性心肌梗死后Exosomes/miR-30a细胞间传递调节心肌自噬的机制研究

杨艳  
【摘要】:第一部分急性心肌梗死患者血清中Exosomes/miR-30a的表达水平目的有研究表明循环microRNA存在于外泌体(Exosomes)中参与多种心血管疾病的发生发展,如急性心肌梗死等,然而与自噬特异基因Beclin-1相关联的miR-30a是否由外泌体携带,且它在急性心肌梗死中的作用尚未明确。本实验的目的是观察外泌体携带的miR-30a在急性心肌梗死患者血清中的表达。方法选取以“胸痛”为主要症状入院的患者145人,其中明确诊断为冠脉阴性患者(对照组)24人,不稳定心绞痛患者20人,急性心肌梗死患者101人,抽取患者入院后第二日清晨及急性心肌梗死患者不同时间点静脉血提取血清。使用相对实时定量PCR方法对患者血清和血清内外泌体中miR-30a的表达水平进行检测,通过蛋白印迹法和流式细胞学检测血清中外泌体的表达水平。各组数据行统计学分析。结果急性心肌梗死患者血清中miR-30a的表达水平存在时间依赖性。不稳定型心绞痛和急性心肌梗死24小时患者血清内外泌体(特异标记其表面标志蛋白CD63)的表达量相对对照组明显增高(2.64±0.27、2.94±0.53 P0.01)。急性心肌梗死患者血清内外泌体表面标志蛋白CD63的水平存在时间依赖性。心肌梗死患者血清外泌体内携带的miR-30a的水平在心肌梗死4小时、24小时明显增高,存在时间依赖性。结论循环miR-30a由外泌体携带,并在急性心肌梗死患者血清中高表达。第二部分Exosomes/miR-30a在细胞间的传递及其对缺氧心肌细胞自噬水平的调节作用目的最近有研究表明,自噬在缺血性心脏疾病中发挥保护作用,然而心肌缺血后自噬的调节机制尚不明确。外泌体是一种纳米囊泡,可携带多种microRNA在细胞间传递。本实验目的在于观察外泌体携带的miR-30a在缺氧心肌中的表达,缺氧心肌分泌的外泌体在细胞间的传递,其携带的缺氧诱导因子(HIF)-la对miR-30a的调节,以及影响外泌体和miR-30a的释放对心肌细胞自噬的调节,来证明外泌体携带的miR-30a在细胞间传递对缺氧心肌细胞自噬水平的调节作用。方法体外培养H9C2大鼠心肌细胞系,构建心肌细胞缺氧模型。通过相对实时定量PCR法对缺氧心肌细胞内和细胞分泌至培养基中外泌体内miR-30a的水平进行检测,心肌细胞转染HIF-la siRNA和加用HIF-1a抑制剂2ME后使用Real-time PCR法检测缺氧心肌细胞内miR-30a的水平。使用蛋白印迹法和流式细胞学检测缺氧心肌细胞分泌外泌体的水平。将缺氧心肌分泌的外泌体与正常培养心肌细胞共培养,通过Real-time PCR法检测心肌细胞内miR-30a的表达水平。使用PKH67试剂使缺氧心肌细胞分泌的外泌体作色,通过激光共聚焦显微镜观察外泌体在细胞间的传递。将经pCT-CD63-GFP转染的H9C2细胞种植入Transwell培养板上室,将未转染心肌细胞种植入下室,使用激光共聚焦扫描显微镜观察外泌体在细胞间的传递。将pSELECT-GFP-mLC3转染入心肌细胞,并将心肌细胞分别三组,分别为对照组,转染miR-30a抑制剂组和使用外泌体抑制剂DMA组,通过激光共聚焦显微镜观察缺氧心肌细胞自噬水平随时间的改变,使用蛋白印迹法检测自噬特异标志物Beclin-1和LC3 Ⅱ/Ⅰ的水平,同时使用Real-time PCR法检测自噬特异标志物Beclin-1和Atg5的水平,分别观察三组心肌细胞自噬水平随时间的变化以明确缺氧心肌细胞自噬水平随时间的变化和外泌体携带的miR-30a对缺氧心肌自噬水平的调节。使用TUNEL法分别分析三组心肌细胞的凋亡。结果缺氧诱导心肌细胞内miR-30a高表达,而抑制缺氧诱导因子(HIF)-1a可抑制缺氧诱导的miR-30a高表达。缺氧后miR-30a可通过外泌体在心肌细胞间传递。缺氧可诱导心肌细胞产生自噬,抑制miR-30a和外泌体的释放可延长缺氧诱导的心肌细胞自噬持续时间。同时,抑制miR-30a和外泌体的释放可增强缺氧引起的心肌细胞凋亡。结论外泌体携带的miR-30a通过旁分泌的形式调节缺氧心肌细胞的自噬水平,它揭示了一种新的自噬调节机制,也许可以为缺血性心肌病的治疗提供新的策略。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R542.22

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