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《华中科技大学》 2018年
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光动力治疗激活自供氧维持的组织因子瀑布式靶向策略治疗淋巴瘤

尹艳雪  
【摘要】:恶性淋巴瘤需要大量的新生血管来提供氧气和营养物质,其新生血管密度明显高于反应性增生的淋巴结。虽然同为供血的通路,肿瘤新生血管形态更加扭曲、杂乱,内皮细胞及基质细胞间隙很大,导致组织因子(tissue factor,TF)易渗漏到血管内,从而使肿瘤血管内皮细胞表面高表达TF,甚至启动凝血瀑布形成血栓而自发血栓性静脉炎(Trousseau' s综合症)。而与肿瘤血管内皮表面高表达TF不同,正常组织只有血管损伤时才会释放TF,启动凝血瀑布。所以选择TF作为恶性淋巴瘤靶点具有一定的特异性。光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT),通过特定波长的光照射单个、多个病变部位,激发病变局部光敏剂,将分子氧(02)转化成辐射半径在10-100nm左右的活性氧(Reactive Oxygen Species,R0S),从而造成照射部位的特异性杀伤效应。其作为具有定向选择性和最小侵袭性的治疗方式,目前已经成为癌症治疗的新的解决方案。其对抗癌症的主要局限在于目前可用的光敏剂的选择性较低,导致与治疗相关的光毒性和对邻近正常组织的副作用较大,而且由于PDT过程是强氧依赖性的,其治疗效果在低氧肿瘤细胞中受到严重阻碍。前期研究中,利用本课题组建立的EGFP-EGF1修饰的TF靶向PEG-PLGA纳米粒,包载光敏剂HMME,成功制备EGFP-EGF1-NP-HMME(ENP-HMME),在PDT的激活下,设计了瀑布式TF靶向策略。研究结果显示,ENP-HMME可以初始靶向至TF高表达的肿瘤血管内皮,瘤体局部PDT照射后R0S释放明显升高,损伤血管内皮诱导更多的TF,从而募集更多的ENP-HMME,活体成像显示照射前肿瘤局部纳米粒浓度为对照组的2.45倍,照射后又提升至3.5倍,而本研究者进一步评估了该策略的效果,小动物PET显示单次PDT后淋巴瘤活性受抑75%。虽然本策略借助R0S损伤内皮促进TF释放,创造以TF为靶点的正放大效应,同时刺激产生TF凝血瀑布造成血栓进而导致局部肿瘤血供中断导致局部肿瘤的杀伤效应,但并未获得研究者最初设想的指数倍增效应。究其原因,可能是与组织肿瘤缺氧限制了PDT的反应,从而限制R0S的生成,进而TF产生受限,影响ENP-HMME聚集正反馈效应。为了克服这个问题,我们在前期研究中的基础上进一步将过氧化氢内酶后包载入ENP-HMME,制备了包载过氧化物酶的载HMMETF靶向纳米粒(CENP-HMME)。过氧化氢酶分解肿瘤内部的过氧化氢产生02,为PDT治疗过程中源源不断地补充氧气,同时改善组织缺氧,以期达到更强的肿瘤靶向效应和肿瘤杀伤效果。本文第一部分为CENP-HMME的制备与表征。参照既往文献,本研究成功构建了CENP-HMME。用其电位/Zeta粒径仪测量其粒径约为160nm,多分散系数(PDI)为0.121,小于0.22,能用于活体实验。同时,将过氧化氢酶包载入纳米粒后,我们宏观观察了其加入过氧化氢中是否有气泡产生,以观察其酶活性;继而用Goth法测量了其酶活性,约为游离过氧化氢酶的10%。同时,我们定量HMME的载药量,约为0.5%~2%,能满足后续细胞、动物实验的需求。本文第二部分为体外实验,评估了纳米粒的的靶向性,生成R0S和TF的能力,以及诱导产生02的能力。以HUVEC为表达TF内皮模型,探索EGFP-EGF1修饰的纳米粒的靶向性。荧光显微镜显示HUVEC对EGFP-EGF1修饰的纳米粒的摄取较无靶向纳米粒升高;流式细胞术进一步定量分析,显示HUVEC对TF靶向纳米粒的摄取约为无靶向纳米粒的1.4倍。该部分进一步评价了 PDT治疗后,HUVEC产生R0S和TF的水平,结果显示PDT能明显诱导HUVEC细胞产生R0S,在转录和蛋白水平均诱导TF表达明显增强。同时,该部分还探索了包载过氧化物酶纳米粒在细胞内诱导产生氧气的能力,以CA46淋巴瘤细胞系为模型,孵育纳米粒,流式细胞术检测,结果提示包载过氧化氢酶的纳米粒可催化产生氧气;该部分进一步检测了 CA46内R0S水平,发现孵育包载过氧化氢酶的纳米粒组较未包载组和空白组,细胞内活性氧水平明显降低。本文第三部分为体内实验,对PDT治疗后纳米粒的的靶向性进行了评价,同时进行了对诱导血栓形成和药效学进行了简单评估,该部分对纳米粒改善肿瘤内部氧供也进行了评价。我们建立了小鼠皮下淋巴瘤模型,活体成像仪观察PDT治疗后肿瘤局部纳米粒的分布,结果显示肿瘤局部纳米粒富集ENP-HMME组是NP-HMME组3.6的倍,包入过氧化氢酶之后,增加到12倍;肿瘤组织切片也显示一致的靶向性,且组织切片显示PDT治疗后肿瘤血管内皮TF表达增强。为了验证包载过氧化氢酶纳米粒改善肿瘤局部氧气供应的能力,对HIF-1a的表达进行了免疫组化染色,结果显示包载过氧化氢酶纳米治疗组较未包载过氧化氢酶纳米组和未治疗组,HIF-1a的表达明显降低,提示包载过氧化氢酶纳米粒可以明显改善肿瘤局部氧气供应。HE染色显示PDT治疗后形成微血栓,诱导血管供应的周围组织的坏死。TUNEL染色简单评价药效,结果显示PDT治疗后,包载CENP-HMME组较ENP-HMME组表现出更多的细胞凋亡和坏死,优于 ENP-HMME。该结果表明包载过氧化物酶的TF靶向纳米粒介导的PDT具有更强的肿瘤靶向效应,同时诱导微血栓形成,造成更强的肿瘤杀伤效应,为肿瘤的治疗提供了新思路。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R733.1

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