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《华中科技大学》 2017年
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真核起始因子eIF3e与亨廷顿蛋白相关蛋白1相互作用并调控神经元突起发育

张博  
【摘要】:真核起始因子(eukaryotic initiation factors,eIFs)是指参与真核翻译起始过程的蛋白质,其种类多且复杂,目前已鉴定的真核起始因子共有12种(eIF1-12)。真核起始因子通过相互之间以及不同的真核起始因子与核糖体、mRNA或起始tRNA之间的相互作用,来完成真核生物的翻译起始。eIF3是哺乳动物中分子量最大和最复杂的真核起始因子,由eIF3a-eIF3m 13种亚基组成。eIF3不仅在蛋白质翻译起始调控中发挥重要作用,多种eIF3亚基,如eIF3ba,eIF3ha,eIF3m,还与胚胎发生和神经发育调节有关。eIF3e是eIF3复合物的第5个亚基,作为“鼠乳腺瘤病毒结合位点6”又被称为INT6。eIF3e在进化中被保留下来,存在于大多数真核生物中,并在人类细胞中广泛表达。eIF3e在翻译过程中加强eIF3复合体的稳定性,提高组蛋白翻译水平,参与mRNA的降解及蛋白降解过程。在胚胎鼠中,eIF3e在发育中的迁移神经嵴细胞中表达,提示其也与神经发育调节有关。亨廷顿蛋白相关蛋白1(huntingtin associated protein 1,HAP1)是最早被发现能与亨廷顿病基因产物亨廷顿蛋白(huntingtin)结合的蛋白,在中枢和周围神经系统中广泛表达。HAP1作为连接微管马达蛋白与被转运物的衔接蛋白,参与胞内运输,同时HAP1还影响很多神经系统疾病的发生发展,在大脑发育及突起可塑性中发挥重要作用。本实验室前期实验曾观察到,eIF3e在小鼠胰岛β细胞瘤细胞INS-1细胞中可与HAP1结合。提示在发育中的迁移神经嵴细胞中表达的eIF3e可能通过与HAP1相互作用参与神经细胞的发育。为探讨eIF3e与神经发育的关系,本研究在明确eIF3e与HAP1相互作用的基础上,检测eIF3e在神经元突起生长中的作用。1.eIF3e与HAP1具有相互作用HAP1根据其C末端氨基酸序列的不同,可至少分为HAP1A和HAP1B两种同工异构体(isoform),其中HAP1A大量以点状或颗粒状的stigmoid小体(stigmoid body)形式存在于神经元胞体和突起内,而HAP1B则主要以弥散形式分布在胞质中。为了进一步明确eIF3e是否与HAP1相互作用,首先观察了eIF3e是否在HAP1A的stigmoid小体上共定位。将HEK293T细胞共转染表达HAP1A-YFP和eIF3e-CFP后,激光扫描共聚焦显微镜观察发现,大量eIF3e-CFP定位在HAP1A-YFP的stigmoid小体上。在HEK293T细胞共转染表达eIF3e-Myc和HAP1A–GFP,通过免疫沉淀分析显示,过表达的eIF3e与HAP1A有强结合能力。荧光共振能量转移(FRET)实验分析显示,在共转染表达HAP1A-YFP和eIF3e-CFP的HEK293T细胞中,eIF3e-CFP与HAP1A-YFP之间具有明显的能量共振转移。在大鼠大脑原代皮质神经元中共转染表达HAP1A-YFP和eIF3e-CFP后,激光扫描共聚焦显微镜观察也发现大量eIF3e-CFP定位在HAP1A-YFP的stigmoid小体上。对大鼠下丘脑切片内源性HAP1和eIF3e进行免疫荧光双标染色观察,可见大量eIF3e定位在HAP1标记的stigmoid小体上。进一步的免疫共沉淀分析显示,小鼠成神经瘤细胞(N2a细胞)及小鼠下丘脑内的eIF3e与HAP1具有明显的相互作用。2.过表达eIF3e抑制神经细胞突起生长突起生长是神经元分化发育的标志之一。为了为证明eIF3e与神经发育的关系提供线索,首先观察了过表达eIF3eCFP对N2a细胞突起生长的影响。在N2a细胞中转染表达eIF3e-CFP、以无血清培养诱导分化后,对细胞突起长度测定显示,过表达eIF3e-CFP的N2a细胞的突起长度明显短于转染表达对照质粒的N2a细胞;表明eIF3e对诱导分化的N2a细胞的突起生长具有明显的抑制作用。在大鼠大脑原代皮质神经元中转染表达eIF3e后,神经元突起的长度明显短于转染表达对照质粒的神经元。由此表明,eIF3e对神经元突起生长具有明显的抑制作用。3.过表达eIF3e降低HAP1水平HAP1对神经元的突起生长具有促进作用。为探讨对蛋白质翻译、降解及mRNA降解具有调控作用的eIF3e是否通过影响HAP1水平而抑制神经元突起生长发育,将N2a细胞过表达eIF3e后,应用Western blot对细胞内HAP1水平进行检测。结果显示,过表达eIF3e的N2a细胞中,HAP1水平显著降低。进一步的RT-PCR检测显示,过表达eIF3e的N2a细胞中HAP1 mRNA水平无明显变化。因此,过表达eIF3e对HAP1水平的下调可能由于影响HAP1 mRNA的翻译过程或HAP1的降解所致。4.过表达HAP1减弱eIF3e对神经突起生长的抑制作用为了进一步明确eIF3e通过下调HAP1水平抑制神经元突起的生长,继而检测了过表达HAP1对过表达eIF3e抑制神经元突起生长作用的影响。结果显示,共转染表达eIF3e-CFP和HAP1A-YFP的N2a细胞和大鼠大脑原代皮质神经元的突起明显长于单转染表达eIF3e-CFP的N2a细胞和大鼠大脑原代皮质神经元。由此表明,HAP1能降低eIF3e对神经元突起生长的抑制作用,eIF3e可通过下调HAP1水平抑制神经细胞突起生长。结论:本研究表明,eIF3e能与HAP1相互作用,通过这种相互作用下调HAP1蛋白水平,进而抑制神经元突起的生长发育。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R338

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