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《华中科技大学》 2017年
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睾丸组织体外培养诱导精子发生的探索性研究

李文静  
【摘要】:第一部分KM幼鼠睾丸组织体外培养诱导精子发生的验证性研究目的验证体外标准组织培养方法gas-liquid界面法在KM小鼠睾丸组织培养过程中的效果。方法选取SPF级7天龄KM雄性小鼠睾丸,获取幼鼠睾丸组织,眼科剪处理至1mm~3大小,加入400ml培养基(RPMI+10%FBS+1%双抗+1mM RA)制成混悬液,接种至六孔板内的低熔点琼脂糖凝胶块表面,34℃,5%CO_2培养箱中培养。分别于7d、14d、21d、28d收取标本进行荧光定量PCR,以及病理包埋切片,HE染色观察生精小管形态学变化,以及kit,crem,sycp3和Acr各阶段标志性基因的表达情况。同时与7,14,21天和28天正常KM小鼠作为对照组进行比较。免疫组化鉴定各时期Acr的表达情况。结果7天KM小鼠生精小管为单层的精原细胞,未见精子发生,正常KM小鼠28开始部分生精小管中可见长形精子。随着培养时间的延长,睾丸生精小管内出现精母细胞,生精小管开始饱满,培养7天后与正常14天小鼠对比生精小管形态基本一致,KM-21D与KM28两组比较生殖细胞标记基因表达有统计学差异,Acr mRNA表达逐渐升高,sycp3培养第七天表达水平有所下降。随后kit和crem mRNA表达趋势与对照组一致。免疫组化发现在KM-21天有Acr的表达的精子细胞样细胞。结论该研究结果进一步证明界面法体外培养KM小鼠睾丸组织能成功启动减数分裂,诱导精子发生。使该方法应用于人睾丸组织培养诱导精子发生提供了一定的实验基础与理论依据。第二部分体外培养非梗阻性无精症患者睾丸组织诱导精子发生的初步研究目的探索体外标准组织培养方法gas-liquid界面法在非梗阻性无精症患者睾丸组织培养过程中的效果。方法收集来我院就诊的行显微取精患者的废弃睾丸组织,新鲜处理。PBS洗涤2′3min,眼科剪剪碎至1mm3大小,加入400ml培养基(RPMI+10%FBS+1%双抗+1mM RA)制成混悬液,接种至六孔板内的低熔点琼脂糖凝胶块表面,34℃,5%CO2培养箱中培养,分别于7d,14d,21d收取标本进行荧光定量PCR,以及病理包埋切片,HE染色,免疫荧光观察生精细胞内变化。分别检测减数分裂前GPR125,DDX4,减数分裂期DMRT1,STRA8以及减数分裂后PRM2和CREM等六个基因m RNA及蛋白质表达水平。最后,采用ACR基因鉴定是否又含有顶体的精子细胞形成。结果该培养体系以及培养方法能够使NOA患者睾丸组织长期存活,促进精子发生。NOA患者STRA8,DDX4,DMRT1和PRM2基因表达在各时期不稳定,极低表达甚至不表达,但CREM和GPR125基因表达量相对稳定,GPR125为精原细胞标记基因,在培养第7天m RNA水平下降,随后逐渐升高;CREM为减数分裂后的标记基因,随着培养时间延长,m RNA表达量并未下降,并有逐渐升高趋势。免疫荧光结果显示GPR125和CREM两个基因蛋白均能稳定表达。经ACR免疫荧光鉴定该患者培养前弱表达,culture-14d、culture-21d以及culture-33d发现ACR表达显著。结论该研究结果证明,该方法应用于NOA患者睾丸组织精子发生的诱导取得了积极的效果。不仅维持了精原细胞的增殖,而且进一步促进和维持了减数分裂的发生。该研究结果提示动物体外精子发生模型应用于人体诱导精子发生具有一定的指导意义,受实验样本例数及组织量局限,因此仍需进一步验证实验结果以及探索和优化培养条件。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R698.2

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