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《华中科技大学》 2017年
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中药复方洁泽1号体外抗HSV-2部分作用机制的研究

艾雷  
【摘要】:第一部分HSV-2感染VK_2/E6E7细胞模型稳定性相关参数的完善【目的】前期课题组已构建相对稳定的体外HSV-2病毒感染VK_2/E6E7细胞模型,但在后期实验中,发现此模型尚有不足之处,为了实验的顺利进行,故对该模型相关参数进行进一步的完善。【方法】由Vero细胞扩增HSV-2,利用半数致组织或细胞病变(TCID50)方法测定收获的HSV-2的毒力,平均每周测定一次,连续测定9周(HSV-2于4℃冰箱中保存)。将收获的于Vero细胞上扩增的HSV-2在Vero细胞上再次扩增,且进行病毒浓缩;观察Vero细胞的病变效应(CPE),选择合理时机收获;将收获的HSV-2稀释5倍、10倍、20倍,与96孔板中的VK_2/E6E7细胞共孵育24h,以MTT方法测定VK_2/E6E7细胞的存活率,评估HSV-2的毒力。选取状态较好的VK_2/E6E7细胞,即细胞呈梭形,如铺路石样且胞质丰富、细胞体积大、细胞膜、细胞核轮廓清晰,进行培养,将HSV-2原液稀释10倍加入已接种此状态的VK_2/E6E7细胞的96孔板中,使其共孵育48h-96h,于倒置显微镜下观察细胞病变情况,选取合适时机收获HSV-2(第1代);将HSV-2病毒(第1代)再次于VK_2/E6E7细胞上复壮72h-96h,待达收获标准后收获HSV-2(第2代),将其稀释5倍、10倍、20倍,并于VK_2/E6E7细胞上用MTT方法测定其存活率,评价第2代HSV-2病毒的毒力;更换不同状态的VK_2/E6E7细胞,即为细胞较圆且体积较前减小、细胞膜、细胞核轮廓不清;核分裂相多样、细胞碎片增多,细胞间凋亡小体亦增多,且对数增长期较前明显缩短,多次重复上述实验,并将实验结果进行对比。【结果】HSV-2病毒经Vero细胞扩增后,Reed-Muench方法测得其TCID50=10~(-7.69),从第1周到第4周,其毒力以TCID50=10~(-0.25)/W的速度下降;第5周到第7周,TCID50=10~(-5.0);第7周到第9周,其毒力再次以TCID50=10~(-0.25)/W的速度下降。将以浓缩方式获得的HSV-2稀释5倍、10倍、20倍,与VK_2/E6E7细胞共孵育24h后,在倒置显微镜下观察VK_2/E6E7细胞的形态,发现稀释5倍、10倍组中的VK_2/E6E7细胞数目减少、大部分细胞均呈圆形、细胞折光性较强;以MTT方法测定VK_2/E6E7细胞的存活率,HSV-2稀释5倍组、10倍组、20倍组的VK_2/E6E7细胞存活率分别为43.5%±1.4%、45.1%±1.1%、48.2%±1.8%。于状态较好的VK_2/E6E7细胞中复壮的HSV-2,以MTT方法测定其毒力为,稀释5倍组、10倍组、20倍组中细胞的存活率分别为44.6%±3.9%、53.3%±3.4%、62.7%±5.1%;在状态不佳的VK_2/E6E7细胞复壮的HSV-2,重复多次,用MTT方法测定其毒力时发现,HSV-2与VK_2/E6E7细胞共孵育24h后,VK_2/E6E7细胞大部分未出现CPE,其存活率为85.7%±4.1%。【结论】HSV-2病毒在4℃冰箱保存时,其毒力会随着时间推移而下降,且毒力以速率为TCID50=10~(-0.25)/W衰减。借鉴前期课题组乔婷婷的研究,将“模型成功建立标准设定为细胞存活率达50%左右”,在Vero细胞中采用浓缩的方法扩增的HSV-2毒力可达到使体外HSV-2感染VK_2/E6E7细胞模型成功的标准,且结果较稳定。状态不佳的VK_2/E6E7细胞不能稳定复壮HSV-2,可知病毒毒力与宿主细胞状态亦可影响HSV-2病毒的复制和包装,表明病毒毒力与宿主细胞状态均是构建HSV-2感染VK_2/E6E7细胞模型的参数。第二部分不同制剂工艺中药复方洁泽1号体外抗HSV-2药效比较【目的】比较临床使用的院内制剂外用洁泽洗液(鄂药制字Z20103135)与精提工艺的洁泽1号体外抗HSV-2病毒的疗效,为后期实验提供借鉴。【方法】设计实验分组,治疗组:HSV-2与VK2/E6E7细胞共孵育30min后弃去上清,再加JZN0.1孵育24h;预防组:JZNO.1与VK2/E6E7细胞共孵育1h后,弃去上清,再加HSV-2孵育24h;干预组:HSV-2、JZN0.1、VK2/E6E7细胞三者共孵育24h,在倒置显微镜下观察VK2/E6E7细胞的CPE,并结合MTT方法,测定VK2/E6E7细胞的存活率,综合评价两者不同工艺制剂的中药复方洁泽1号抗HSV-2病毒的药效。【结果】病毒感染组细胞的形态约50%左右呈现圆形,细胞折光性较强,且细胞数量较正常组明显减少;与病毒感染组相比,两种制剂工艺药物中的治疗组和干预组的细胞较多呈梭形,细胞数量较病毒感染组多,且干预组的梭形细胞比例较治疗组多;但两种制剂工艺药物中预防组的细胞形态及数量均与病毒感染组无明显差异。MTT结果如下:精提工艺的洁泽1号干预组、治疗组、预防组的细胞存活率分别为:98.2%?4.6%、82.2%?2.7%、42.5%?3.6%;临床使用的院内制剂鄂药制字Z20103135干预组、治疗组、预防组的细胞存活率分别为:62.1%?2.4%、57.0%?2.1%、42.6%?2.2%。经统计学分析:两种工艺制剂的洁泽1号治疗组和干预组与各自的病毒感染组相比,均有统计学差异(P〈0.05),但两种工艺制剂的洁泽1号预防组与相应的病毒感染组相比,无统计学差异(P〉0.05);精提工艺的洁泽1号干预组、治疗组与临床使用的院内制剂鄂药制字Z20103135干预组、治疗组相比,均有明显统计学差异(P〈0.001)。【结论】两种制剂工艺的洁泽1号在治疗和干预方面,均有抗HSV-2病毒感染的作用,且干预作用优于治疗作用;但采用先药物与VK2/E6E7细胞共孵育1h,再加HSV-2共孵育此种预防方法,两种制剂工艺的洁泽1号均表现出无抗HSV-2病毒感染的作用,提示在此种处理方式下,药物无干预病毒效应;精提工艺的洁泽1号体外抗HSV-2疗效优于临床使用的院内外用制剂洁泽洗液。第三部分中药复方洁泽1号体外抗HSV-2作用时间的研究【目的】前期实验证实体外JZNO.1确有抗HSV-2感染的作用,揭示JZNO.1抗HSV-2作用机制,探讨HSV-2、VK2/E6E7细胞、JZNO.1三者孵育时间,进一步明确JZNO.1是否对HSV-2粘附及穿入宿主细胞有影响,为后续研究奠定基础。【方法】将达到模型成功标准的HSV-2与VK2/E6E7细胞共孵育5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min后,弃去上清,加Cn-TPR培养基孵育24h,采用MTT方法,测定细胞存活率,以进一步明确HSV-2穿入VK2/E6E7细胞的时间。参考文献可知,在4℃环境下,可减少HSV-2粘附VK2/E6E7细胞,甚至达到仅粘附而不穿入的状态,从而展开JZNO.1是否对HSV-2粘附和穿入影响的探索。VK2/E6E7细胞在4℃冰箱预冷30min后,进行实验分组:病毒感染组(V24h):HSV-2+VK2/E6E7细胞在4℃冰箱孵育20min,后继续在37℃、5%CO2培养箱中培养24h;病毒感染组(V20min):HSV-2+VK2/E6E7细胞在4℃冰箱孵育20min,后弃去上清,加Cn-TPR培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养24h;药物干预20min组(JV20min组):JZNO.1、HSV-2、VK2/E6E7细胞三者在4℃冰箱孵育20min,后弃去上清,加Cn-TPR培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养24h;药物干预24h组(VJ24h组):HSV-2+VK2/E6E7细胞4℃冰箱孵育20min,后弃去上清,加JZNO.1在37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h,以MTT方法测定细胞的存活率。【结果】5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min组与正常组相比,有统计学差异(P〈0.05),但各时间点之间相比,无明显统计学差异;病毒感染组V24h与病毒感染组V20min相比,有统计学差异(P〈0.05),提示温度降至4℃,确实能减少HSV-2的穿入;药物干预20min组(JV20min组)、药物干预24h组与病毒感染组V20min相比,均有明显统计学差异(P〈0.05)。【结论】HSV-2在5min内即可穿入VK2/E6E7细胞;温度降至4℃时,能减缓HSV-2的穿入,基于此理论与实验结果,推测JZNO.1可能影响HSV-2对VK2/E6E7细胞的粘附和穿入;同时,药物与HSV-2在4℃下共孵育20min,即显示良好的抗病毒作用,提示药物亦可能在HSV-2感染VK2/E6E7细胞的早期即发挥了抗病毒作用。第四部分中药复方洁泽1号对HSV-2病毒囊膜g D蛋白表达的影响【目的】前期实验发现中药复方洁泽1号可能影响HSV-2的粘附和穿入,而病毒表面囊膜蛋白g D在介导HSV-2粘附和穿入VK2/E6E7细胞的过程中发挥重要作用,故采用免疫荧光技术观察中药复方洁泽1号是否影响g D蛋白的表达,为药物抗病毒机制提供实验依据。【方法】实验分组,正常组:Cn-TPR培养基+VK2/E6E7细胞共孵育30min、6h、12h、24h;病毒感染组:HSV-2与VK2/E6E7细胞共孵育30min、6h、12h、24h;药物组:HSV-2、VK2/E6E7细胞、JZNO.1三者共孵育30min、6h、12h、24h;采用免疫荧光技术,观察g D蛋白的表达。【结果】30min、6h的病毒感染组未观察到特异性荧光蛋白的表达,但在12h、24h两个时间点均可见g D蛋白的表达,且24h表达量较12h明显增多;药物组30min、6h、12h、24h均未看到特异性g D蛋白的表达。【结论】HSV-2囊膜g D蛋白随着时间的推移,表达量逐渐增多;中药复方洁泽1号可明显的减少g D蛋白表达的作用,从而发挥其良好的抗HSV-2感染的作用。第五部分洁泽1号体外对HSV-2感染VK2/E6E7分泌细胞因子的影响【目的】明确上述细胞因子在病毒感染中的作用,探讨洁泽1号对体外HSV-2感染VK2/E6E7细胞分泌细胞因子(IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α)的影响。【方法】实验分组,病毒感染组:HSV-2与VK2/E6E7细胞共孵育2h、4h、6h、12h、18h、24h;药物组:HSV-2、VK2/E6E7细胞、JZNO.1三者共孵育2h、4h、6h、12h、18h、24h;正常组:HSV-2与Cn-TPR培养基共孵育2h、4h、6h、12h、18h、24h。收取每组相应时间点的上清,于4℃、3000rpm/min离心15min,对收获的上清进行分装,-80℃冰箱保存。采用流式CBA(Cytometric Beads Array)方法检测各组IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α细胞因子的含量。【结果】IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-12细胞因子的含量在正常组、病毒感染组和药物组三组中均处于较低表达水平,HSV-2病毒感染VK2/E6E7细胞经洁泽1号药物治疗后,IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-12细胞因子各时间点的含量与病毒感染组相比,其表达水平显著提高,有统计学差异(P〈0.05);IL-6细胞因子在正常的VK2/E6E7细胞中低表达,HSV-2感染后,IL-6明显高表达与正常组,有统计学差异(P〈0.001),洁泽1号药物组IL-6水平低于病毒感染组,无统计学差异(P〉0.05);正常VK2/E6E7细胞分泌IL-8细胞因子,在HSV-2感染6h内,药物组IL-8分泌量较病毒感染组稍降低,但无统计学差异(P〉0.05),随后,药物组IL-8含量高于病毒感染组,有统计学差异(P〈0.05)。【结论】洁泽1号能促进IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-12和IL-8的表达,能同时增强免疫反应,这对机体清除HSV-2病毒有一定意义。另外,洁泽1号提高Th1型细胞因子IL-12和降低Th2型细胞因子IL-6分泌,促使免疫反应向Th1方向漂移,有助于病毒清除。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285

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