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《华中科技大学》 2019年
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UBIAD1抑制膀胱癌细胞生长机制的研究

许志亮  
【摘要】:UBIAD1(ubiA prenyltransferase domain-containing protein 1)是一个九次跨膜的异戊烯转移酶,具有体内合成MK-4和CoQ10的功能,在很多生物学过程中发挥着重要作用。UBIAD1是线粒体维生素K的合成酶,可以调节线粒体的电子传递链,稳定线粒体膜电势和影响ATP的合成,UBIAD1缺失会导致线粒体功能丧失,引起帕金森疾病。UBIAD1参与高尔基体上CoQ10合成,调节内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性,调节细胞氧化还原过程,UBIAD1缺失会导致eNOS解偶联,导致大量活性氧(ROS)积累,从而对细胞造成氧化损伤,引起心血管相关疾病发生。UBIAD1通过与HMG-CoA还原酶相互作用参与胆固醇的合成,调节细胞内脂质代谢,UBIAD1定点突变阻止HMG-CoA还原酶降解并导致脂质大量堆积,引起施耐德结晶状角膜营养不良症(SCCD)。另外UBIAD1在肿瘤的发生过程起着作用,在膀胱癌,前列腺癌和肾癌中UBIAD1表达量下调,在这些癌症细胞内外源转入UBIAD1会导致细胞生长受到抑制。在本实验室以前的研究中发现,UBIAD1缺失激活Ras/MAPK信号通路,但其作用机制并没有研究清楚。基于这一点,在本文中,我们探索了UBIAD1调节Ras/MAPK信号通路的相关机制。我们的研究发现外源表达UBIAD1会抑制膀胱癌T24细胞内Ras/MAPK信号、T24细胞活力和细胞增殖,并且UBIAD1的缺失会激活Ras/MAPK信号通路。选用不同的Ras/MAPK信号通路的抑制剂处理缺失UBIAD1的细胞发现,UBIAD1在Ras/MAPK中的作用位点是Ras蛋白。为了进一步的探究UBIAD1蛋白对H-Ras的作用,通过共聚焦显微镜观察发现,UBIAD1阻止H-Ras的转运,使其在高尔基体滞留;沉默UBIAD1会导致H-Ras在细胞膜上聚集。通过蛋白共定位分析、蛋白荧光能量共振转移技术、蛋白双分子荧光互补实验和免疫共沉淀实验方法确定了UBIAD1与H-Ras蛋白的相互作用。通过截短体实验发现UBIAD1与H-Ras的羧基端存在相互作用。我们利用他汀类药物来抑制UBIAD1的底物(香叶基香叶基焦磷酸GGPP)来源和利用RNAi沉默GGPPS(GGPP合成酶)特异性的减少细胞内GGPP,通过免疫共沉淀、激光共聚焦、免疫印迹和细胞活力检测我们发现他汀类药物和si-GGPPS可以有效的抑制UBIAD1的功能:UBIAD1和H-Ras的相互作用,UBIAD1对H-Ras的滞留现象,UBIAD1对Ras/MAPK信号通路的抑制和UBIAD1抑制T24细胞增殖,这说明GGPP在其中发挥着重要的作用。此外,由于UBIAD1可以在高尔基体上合成CoQ10并调节eNOS活性,所以eNOS可能参与UBIAD1-H-Ras蛋白复合体中,为了验证这一点,我们利用L-NAME(eNOS抑制剂)实验发现,L-NAME可以减少UBIAD1-H-Ras的相互作用和消除UBIAD对H-Ras的抑制作用。通过免疫共沉淀发现UBIAD1/eNOS/H-RAS之间存在相互作用。为了验证UBIAD1-eNOS-H-Ras复合体在生物体内的作用,我们用果蝇作为动物模型发现,heix(UBIAD1的同源基因)的缺失会导致黑色素瘤的发生。Ras/MAPK信号通路抑制剂和Ras抑制剂可以显著抑制肿瘤发生,这说明果蝇黑色素瘤的发生与Ras/MAPK信号通路相关。另外我们发现他汀类和L-NAME可以促使肿瘤的形成。这些数据都和细胞实验相符合,说明果蝇黑色素瘤的形成是与UBIAD1-eNOS-Ras相关的。综上所述,在我们的研究中,UBIAD1/eNOS/H-Ras相互作用,使H-Ras滞留在高尔基体,阻止了H-Ras转运到细胞膜,从而抑制了Ras/MAPK信号通路和膀胱癌T24细胞的活力。而UBIAD1缺失则会使Ras转运至细胞膜和使eNOS解偶联,激活细胞内Ras/MAPK信号和产生大量活性氧,促进细胞增殖,最终引发肿瘤。因此,我们的研究结果可以很好的为探索UBIAD1在抑制膀胱癌的生长的机制,治疗膀胱癌药物研发和预防肿瘤发生的方法提供理论基础。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R737.14

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