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《华中科技大学》 2019年
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FDISCO:用于整体器官成像的组织光透明方法研究

齐毅松  
【摘要】:生物组织的三维结构为神经科学、系统生物学的研究提供了重要的信息。光学显微成像与组织荧光标记技术结合,可以获取亚细胞分辨率的三维组织结构,但生物组织的混浊特性限制了光在组织中的穿透深度,阻碍了大体积组织或整体器官的三维成像。近年发展起来的组织光透明技术可以降低组织对光的散射,使组织“透明”化,从而实现生物组织的三维光学显微成像。目前,研究者们已经发展了多种离体组织光透明方法,广泛用于鼠脑等生物组织的三维荧光成像。然而,现有的光透明方法针对完整组织器官的透明及成像效果仍有不足,尚缺乏同时具备高效组织透明能力和高荧光保持能力的离体组织光透明方法。本文的研究工作是围绕适用于整体器官成像的组织光透明方法展开,旨在发展一种兼顾组织透明能力和荧光保持能力的高效组织光透明方法,实现整体器官的三维成像。主要内容如下:(1)新型组织光透明方法的建立:在3DISCO方法的基础上,探究透明试剂的不同温度和p H条件对增强型绿色荧光蛋白稳定性的影响,筛选利于荧光保持的条件,进而建立具备高荧光保持能力的组织光透明方法FDISCO;进一步验证了该方法对多种荧光蛋白和化学荧光染料都具有高水平的信号保持能力。(2)FDISCO与其他整体器官透明方法的比较研究:将FDISCO方法用于小鼠全脑的透明成像,并从组织透明度、透明时间、样本形态变化、荧光信号强度和成像深度等方面与其他用于整体器官的光透明方法进行比较。结果显示,FDISCO方法具有更优的透明能力及更好的成像效果,可以实现小鼠全脑的整体成像。此外,FDISCO方法还可以用于小鼠和大鼠的多种组织器官的透明,包括软组织和硬组织,因而具有广泛的适用性。(3)基于FDISCO的整体器官神经与血管成像:结合荧光标记技术(转基因小鼠、病毒示踪及荧光染料)、FDISCO透明和光片照明显微镜成像,对大鼠、小鼠多种完整组织器官的神经和血管网络进行三维成像,实现了鼠脑、脊髓、骨骼肌和肾脏中完整神经和血管结构的三维重建,并对其中的结构单元(如鼠脑中的神经元胞体、肌肉中的运动终板和肾脏中的肾小球等)进行了量化统计。更为重要的是,FDISCO方法不仅拥有长效的荧光保存能力,可在超过一年的时间内对透明后的组织进行重复成像,而且可用于多种病毒标记鼠脑的整体成像。综上所述,本研究基于3DISCO方法发展了一种具备高效组织透明能力和高荧光保持能力的新型离体组织光透明方法FDISCO。该方法不仅保留了3DISCO所具有的简单、快速、样本收缩和适用于光片照明系统成像的优点,也克服了3DISCO方法严重衰减荧光的不足。基于此,本文实现了多种组织器官的神经和血管网络的三维结构重建,并验证了FDISCO特别适用于弱荧光标记的鼠脑的三维成像。FDISCO方法为大体积生物组织的神经、血管等结构的三维可视化和分析提供了重要工具,有望广泛用于生理学和病理学的研究中。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R318;O657.3

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1 齐毅松;FDISCO:用于整体器官成像的组织光透明方法研究[D];华中科技大学;2019年
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