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木薯蛋白磷酸酶基因MePP2C24/26在ABA介导的干旱应答中的功能研究

吴春来  
【摘要】:作物在整个生命周期中常常遭受各种逆境胁迫,如干旱、高盐、低温、病害等,这些不利的环境因素会影响作物的生长发育,甚至造成产量和品质的下降。木薯广泛种植在亚洲、非洲和南美洲,是世界第六大粮食作物,是热带和亚热带地区的第三大粮食作物,是世界7亿人口的主粮。木薯具有耐旱的特性,可作为研究作物耐旱机制的典型材料。脱落酸(Abscisic acid,ABA)在调控植物耐旱性方面发挥着重要作用,目前对热带特色耐旱作物中ABA介导耐旱机制的研究还非常有限。本研究通过木薯长非编码RNA(lnc RNAs)分析,鉴定出两个ABA信号重要调控因子2C型蛋白磷酸酶(Protein phosphatase 2C,PP2C),Me PP2C24/26。利用生物信息学、分子生物学、遗传学和生理学等研究方法,分析了Me PP2C24/26上下游互作组分,解析了Me PP2C24/26在ABA介导的干旱应答中的机制,主要研究结果如下:1)通过生理学分析发现,在聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)和ABA处理下木薯叶片过氧化氢含量,以及过氧化物酶、过氧化氢酶的酶活力显著上升。利用链特异性高通量测序技术,对PEG和ABA处理下木薯叶片中差异长非编码RNA进行了分析,解析了其顺式调控、反式调控和微小RNA的靶标,发现木薯lnc RNAs可以通过ABA依赖的信号通路和ABA非依赖的信号通路响应干旱胁迫,识别了一些响应干旱和ABA的差异表达lnc RNAs和基因,包括ABA信号途径关键调控因子Me PP2C24/26基因。2)利用生物信息学的方法,在木薯基因组中鉴定出了13个ABA信号受体(PYLs)、80个PP2Cs和10个蛋白激酶(Sn RK2s)。进化分析表明,木薯中PYLs可分为3个亚家族,PP2Cs分为13个亚家族,Sn RK2s分为3个亚家族,其中,Me PP2C24/26属于A亚家族。利用RT-PCR技术从木薯中克隆了Me PP2C24/26基因的c DNA序列,亚细胞定位分析表明,Me PP2C24/26都定位在细胞核中,表达分析表明Me PP2C24/26均受ABA、甘露醇、Na Cl和茉莉酸甲酯(Me JA)诱导上调。3)酵母双杂交实验发现,在不含ABA的酵母培养基上,Me PP2C24可与Me PYL1和Me Sn RK2.1互作;在含ABA的酵母培养基上,Me PP2C24可与Me PYL-1、-4、-7、-8、-9、-11、-12、-13和Me Sn RK2.1互作。另外,在不含ABA的酵母培养基上,Me PP2C26可与Me PYL-1、-5、-6、-7、-8、-11、-13和Me Sn RK2.1互作;在含ABA的酵母培养基上,Me PP2C26与Me PYL-1、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-11、-12、-13和Me Sn RK2.1互作。同时,还发现Me Sn RK2.1可与下游Meb ZIP11和Meb ZIP67互作。利用双分子荧光互补技术进一步验证了其中7对蛋白在细胞核中互作。这些结果表明,Me PP2C24/26在有外源ABA时,能够与更多的Me PYLs成员互作,但Me PP2C24/26与Me Sn RK2.1,以及Me Sn RK2.1与Meb ZIP-11、-67的互作却不受外源ABA的影响。通过双荧光素酶技术,检测了Me PP2C24/26基因的启动子活性,显示其全长启动子具有较高活性。通过酵母单杂交实验,证明了木薯Meb ZIP11和Meb ZIP27可与Me PP2C24启动子互作,并通过不同片段启动子缺失的酵母单杂交实验,确定了Meb ZIP11和Meb ZIP27能与含ABRE顺式作用元件的Me PP2C24启动子区段互作。4)利用农杆菌介导的遗传转化方法在拟南芥中表达Me PP2C24/26基因可降低转基因株系的种子萌发和根生长对ABA的敏感性;而且,表达Me PP2C24/26降低了转基因株系对干旱胁迫的耐受性。生理分析发现Me PP2C24/26基因表达株系的抗氧化酶活力下降,膜损伤及细胞内的氧化损伤程度增加。通过对ABA依赖的干旱胁迫响应基因的表达分析发现,响应干旱胁迫的正调控基因的表达量在表达Me PP2C24/26基因的转基因株系中比其在野生型中更低。本研究通过对木薯响应PEG和ABA处理下的lnc RNA进行系统分析,鉴定到ABA信号途径关键调控因子Me PP2C24/26,并揭示了其互作蛋白。在拟南芥中表达Me PP2C24/26后,发现其负调控ABA信号和干旱胁迫耐受性。


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