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《华中科技大学》 2004年
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化学修饰胰岛素的制备、表征和生物活性

黄涛  
【摘要】:胰岛素(insulin, ins)是治疗糖尿病的最有效药物,因其易被胃肠道内蛋白酶所降解,故不能口服。化学修饰胰岛素可以保持胰岛素降血糖活性,提高胰岛素的稳定性,延长体内作用时间,改变胰岛素脂溶性,增强胰岛素的透膜吸收,而且有可能增强胰岛素抵抗蛋白水解酶降解的能力,从而有可能实现胰岛素的口服。本文利用合适的修饰剂在非保护条件下对胰岛素的LysB29的(-NH2进行选择性修饰,得到了几种(-NB29-单酰化的胰岛素,对修饰产物进行了表征,并考察了所得到的修饰胰岛素的生物活性、抗胰蛋白酶降解能力以及受体亲和性。主要内容包括: 1. 采用二环己基碳二亚胺(DCC)法或酰氯法对修饰剂进行活化,制备了硫辛酰苯并三唑、去氢胆酰苯并三唑、油酰苯并三唑、亚油酰苯并三唑、硬脂酰苯并三唑、硬脂酰甘氨酸酰化苯并三唑、乙酰胆酰苯并三唑等一系列活化酰胺,并用IR和1HNMR对酰化苯并三唑进行了表征。 2. 利用活化酰胺法以(-硫辛酸(LA)、去氢胆酸(DHC)、油酸(OA)和亚油酸(LOA)等为修饰剂在非保护条件下对胰岛素进行选择性酰化,得到了硫辛酰胰岛素、去氢胆酰胰岛素、油酰胰岛素和亚油酰胰岛素等一系列新的胰岛素类似物。产物经普通不连续PAGE初步分析表明,硫辛酸酰化胰岛素和去氢胆酸酰化胰岛素电泳迁移速率比未修饰胰岛素快。利用RP-HPLC技术分别对硫辛酸和去氢胆酸修饰胰岛素成功地进行了分离和纯化,结果显示单修饰胰岛素为主要产物,随着修饰度的增大,色谱保留时间延长;在各自的修饰产物中,单硫辛酰胰岛素含量约73%,单去氢胆酰胰岛素约66%,并成功地利用色谱方法分别制备了纯度95%以上的单硫辛酰胰岛素和单去氢胆酰胰岛素。 3. 利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分别确定了LA、DHC、OA和LOA修饰胰岛素粗产物的组分及分子量,每种修饰粗产物实测的各组分的分子量与对应的修饰物理论值完全吻合。单硫辛酰胰岛素、单去氢胆酰胰岛素的含量与其RP-HPLC结果吻合。并且OA和LOA修饰产物的飞行质谱结果显示主要的修饰产物亦为单酰化胰岛素,二酰化产物较少,未检测到三修饰产物,尤 WP=6 其是亚油酸对胰岛素的修饰显示出较高的单酰化选择性。对硫辛酰胰岛素和去氢胆酰胰岛素,结合修饰胰岛素酶解混合物的MALDI-TOF-MS结果,确定了修饰位点,证实酰化作用的主要位点为LysB29的ε-氨基,即主要的修饰产物分别为ε-NB29-硫辛酰胰岛素、ε-NB29-去氢胆酰胰岛素。 4. 通过动物实验考察了几种修饰胰岛素的体内降血糖活性和体外抗酶解能力。结果表明,所得到的几种酰化胰岛素对降血糖活性无影响,并且,与天然胰岛素相比,(-NB29-硫辛酰胰岛素、(-NB29-去氢胆酰胰岛素以及亚油酰胰岛素的体内作用时间有一定延长,抗胰蛋白酶降解的能力显著提高,其中,(-NB29-硫辛酰胰岛素抗酶解能力最强。抗酶解能力的增强主要是由于修饰基团较好地保护B链C-端区域,在一定程度上阻碍了胰蛋白酶对LysB29酰胺键的破坏作用。 5. 通过与125I-胰岛素对大鼠肝细胞膜胰岛素受体的竞争结合实验,证实(-NB29-硫辛酰胰岛素和(-NB29-去氢胆酰胰岛素的受体结合能力均高于天然胰岛素,结合能力分别是天然猪胰岛素的4.8倍和3.6倍。LA或DHC对胰岛素LysB29的共价修饰使B链羧端变得更加伸展,以致两性平面更加暴露,从而使胰岛素分子更易于与其受体结合。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:TQ467

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