从山羊草中分离小麦籽粒硬度主效基因突变体的研究

【摘要】：小麦硬度主要由小麦硬度主效基因Puroindoline A (PinA) 和Puroindoline B (PinB) 决定,两者中任一基因发生突变或缺失均会对籽粒硬度造成不同的影响。山羊草属是与小麦属遗传关系最近的小麦野生近缘植物,也是小麦品种改良的重要基因源。为了丰富小麦类作物籽粒硬度基因库,为我国的小麦品质改良工作奠定基础,本研究对成熟种子中Puroindolines 蛋白的分析方法及山羊草中PinA 的同源基因进行了分离和分析,主要研究内容和方法如下: (1)Puroindoline 蛋白电泳分析系统的建立和优化:从二倍体、六倍体小麦材料及小麦近缘种粗山羊草成熟种子中提取Puroindoline 蛋白,通过实验对Puroindoline蛋白SDS-PAGE 电泳及染色条件进行了优化和讨论,建立了浓缩胶T(凝胶浓度)为4,C(交联度)为2.6,电泳电压为128V; 分离胶T 为13.5,C 为2.6,电泳电压240V,分离胶电泳时间1.5h 的电泳结果稳定且重复性好的优化的SDS 凝胶电泳条件。同时还引进了电泳条带分析效果更为清晰的尿素凝胶电泳,并对考马斯亮蓝染色(蓝染)和硝酸银染色(银染)两种染色方法的染色浓度范围和染色效果做了比较,并获得了良好的实验效果,为小麦中Puroindoline 基因的进一步研究奠定了基础。 (2)山羊草中PinA 基因突变体的筛选:根据已报道的PinADNA 序列,设计了PinA 的简并引物,以山羊草属(Aegilops)四个组34 份材料中的基因组DNA 为模板,在优化的PCR 体系下进行扩增,并对分离出的25 个扩增产物进行测序,用DNAstar软件与GenBank 中的序列做比对,结果表明,7 个测序序列与GenBank 已有序列完全相同,但材料来源不同; 14 个序列确定为PinA 的新型突变体,它们之间同源性为97.8%到100%,序列全长均为447bp,除RM0070 和RM0072 两种材料的PinA 由于点突变使色氨酸结构域(WWKWWK)中的第二个W 突变为终止子,及RM0032 和RM0051 材料中PinA 所产生的点突变在色氨酸结构域外也产生了终止子之外,其它序列均编码了富含色氨酸区域的149 个氨基酸残基。