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富硒蚕蛹氨基酸和新硒蛋白的研究

胡德聪  
【摘要】:硒是生物必需微量元素,适量补硒能预防癌症。蚕蛹蛋白质含量高、氨基酸组成丰富,具有调节免疫的功能。为寻找更有效的防癌、低毒硒化合物,本文对中国第二大富硒区——陕西紫阳的蚕蛹进行蛋白质分离,并通过原子荧光仪测定全蛹及其蛋白质中的硒含量。发现紫阳蚕蛹中的硒含量为普通地区蚕蛹的215 倍,而且硒主要存在于蛋白质中。氨基酸组成分析表明:紫阳富硒蚕蛹氨基酸中硒代蛋氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、酪氨酸等含硒、硫和酚基的氨基酸含量比普通蚕蛹高,而普通蚕蛹中含烷基的氨基酸含量较富硒蚕蛹高。将富硒蚕蛹氨基酸与人肝癌细胞共同培养,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长活力、光学和荧光显微镜观察细胞形态、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化,结果表明:含0.5, 1.5, 和2.5 μmol/L 硒的富硒蚕蛹氨基酸能抑制人肝癌细胞SMMC-7721 的生长、改变细胞的形态和周期,并诱导细胞凋亡。相反,普通蚕蛹氨基酸却促进细胞的生长。同样硒浓度下,亚硒酸钠和硒代蛋氨酸抑制细胞的作用不显著。采用倒置荧光显微镜检测胞内活性氧(ROS),发现富硒蚕蛹氨基酸可诱导胞内ROS 含量增加,而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)可部分抑制富硒蚕蛹氨基酸所致胞内ROS 含量的增加。上述结果说明,富硒蚕蛹氨基酸比亚硒酸钠和硒代蛋氨酸具有更高的抑制肝癌细胞生长的能力,其作用机理为诱导产生胞内ROS、并介导细胞凋亡。 为研究富硒蚕蛹氨基酸诱导人肝癌细胞凋亡的有效组分,本文通过跟踪蛋白质及各分离组分的硒含量和蛋白质含量,采用丙酮沉淀、DEAE-Sepharose (Fast Flow)阴离子交换层析、Sephadex G-75 凝胶过滤层析等手段,对富硒蚕蛹蛋白进行逐级分离。用十二烷基硫酸钠-凝胶电泳(SDS-PAGE)和二维凝胶电泳鉴定蛋白质纯度。结果表明: 经上述各步分离后,剩下两个主要蛋白质。通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱(MALDI-TOF-MS)测定胰蛋白酶切后的肽质量指纹谱图(PMF)和Mascot 检索NCBI 数据库,鉴定其中一种蛋白为性别特异性贮存蛋白2 前体(sex specific storage protein 2 precursor), 而另一种蛋白为目前数据库中不存在的新蛋白。采用毛细管色谱-电喷雾电离-串联质谱(CapLC-ESI-MS/MS)测定该新蛋白的部分


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