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《华中科技大学》 2006年
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腺病毒介导的大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体短发夹RNA在SHR的基因沉默作用研究

肖传实  
【摘要】:第一部分 编码大鼠AT1-R mRNA的shRNA真核表达载体的构建 目的:构建编码大鼠AT1-R mRNA的shRNA真核表达载体质粒,为利用基因沉默技术从转录后水平进行高血压治疗的研究做准备。 方法:根据大鼠AT1受体mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,并进行酶切鉴定和测序。 结果:酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与与设计的相同,获得大鼠AT1受体的shRNA表达载体质粒。 结论:构建的编码大鼠AT1-R mRNA的shRNA真核表达载体可进入哺乳细胞内表达短发夹RNA,经Dicer酶裂解成siRNA并降解靶基因mRNA,而达到基因干扰的作用。为利用其进行自发性高血压大鼠的降压治疗研究奠定了基础。 第二部分 大鼠AT1-R基因的shRNA在哺乳细胞中的功能表达 实验一 靶向大鼠AT1-R基因的短发夹RNA在哺乳细胞中的基因沉默作用 目的:构建编码大鼠血管紧张素Ⅱ受体基因mRNA的短发夹RNA真核表达载体质粒,研究体外培养的哺乳细胞中siRNA抑制靶基因表达的有效性,为利 用基因沉默技术从转录后水平进行高血压治疗的研究做准备。 方法:根据大鼠AT1受体mRNA序列设计并合成shRNA核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1。用构建完成的pGenesil-1-shRNA质粒和重新洗牌的对照质粒转染大鼠胶质瘤细胞,并在不同时相收集转染的细胞,进行RT-PCR和Western blot检测。 结果:抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似。与对照组相比,在转染后48小时血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到35.5±3%,72小时后达到最低点(20.7±4%)。而与对照组相比,血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24小时和48小时分别减少至46.9±4.2%和36.98±3.7%,最大减少在转染后72小时(28.1±4%)。 结论:成功地构建了编码大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA的短发夹RNA真核表达载体后,在体外转染哺乳细胞中表达shRNA可有效地抑制靶基因的表达,并导致其蛋白的翻译受到抑制,达到基因干扰的目的。为利用RNAi从转录后水平对心血管疾病进行治疗做有益的探索,为进一步研究基因沉默在自发性高血压大鼠的降压治疗研究奠定了基础。 实验二 靶向血管紧张素Ⅱ受体基因干扰及有效shRNA的筛选 目的:RNA干扰是基因技术的重要进展,人们可以在转录后水平减少基因的表达。对siRNA是否有效而言,基因靶序列的选择是至关重要的因素。我们研究了哺乳细胞中shRNA调节大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达的有效性并探索有效shRNA的特征与shRNA功能性之间的关系。 方法:设计并构建四个靶向大鼠AT1受体基因的shRNA表达载体。四个shRNA靶向同一基因的不同区域。合成shRNA寡核苷酸片段的正义链和反义链,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1。用构建完成的pGenesil-1-shRNA质粒和重新洗牌的对照质粒转染大鼠胶质瘤细胞,并在不同时相收集转染的细胞,进行RT-PCR和Western blot检测。 结果:转染24小时之后,各处理组均未见AT1mRNA水平有明显减少。与 对照组相比,Pb组在转染后48小时血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到55.7±7.6%,72小时后达到最低点(43.7±8.2%)。其它组AT1受体mRNA表达无明显抑制(P>0.05)。抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似。与对照组相比,Pb组血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24小时和48小时分别减少至46.9±4.2%和36.98±3.7%,最大减少在转染后72小时(28.1±4%)。 结论:成功地构建了编码大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA的短发夹RNA真核表达载体后,在体外转染哺乳细胞中表达shRNA可有效地抑制靶基因的表达,并导致其蛋白的翻译受到抑制,达到基因干扰的目的。在选择有效的shRNA序列时,除了一般的原则之外,我们认为靶位mRNA的环状结构以及siRNA是否能到达靶位对基因干扰实验能否成功具有重要作用。 第三部分 靶向大鼠AT1-R基因的shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定 目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建大鼠AT1-shRNA腺病毒载体并在293细胞中扩增制备重组病毒。 方法:自先期构建的pGenesil-1-AT1R-shRNA真核表达载体中用RT-PCR法扩增出AT1R-shRNA片段,将其克隆入PUC18质粒中。酶切构建好的pUC18-AT1R-shRNA载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-AT1R-shRNA载体和骨架病毒pBHGlox△1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。 结果:经限制性内切酶、PCR检测和GFP表达证实成功地构建了携带AT1R-shRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。 结论:成功地构建了携带AT1R-shRNA片段的重组腺病毒载体,为进一步抗血压研究奠定了基础。 第四部分 腺病毒介导的大鼠AT1-shRNA在自发性高血压大鼠的在体研究 实验一 腺病毒介导的AT1-shRNA对SHR降压作用的实验研究 目的:本研究旨在讨论以重组腺病毒为载体的血管紧张素Ⅱ—1型受体(AT1R)的shRNA(Ad5-AT1R-shRNA)对自发性高血压大鼠血压的作用效果及对组织AT1R基因表达的影响。 方法:在293细胞内扩增荧光蛋白标记的携带AT1R shRNA的重组腺病毒,TCID_(50)法测定病毒滴度,经鼠尾静脉注射。注射前及注射后每天定时监测血压,采用定量PCR检测AT1R mRNA的表达,在荧光显微镜下观察组织对Ad5-AT1R-shRNA的吸收情况。 结果:给予Ad5-AT1R-shRNA的实验组SHR血压下降达5天,降压最长可维持7天,最大降压幅度可达28.902mmHg;Ad5-AT1R-shRNA可抑制SHR AT1R基因在转录和转译上的表达,抑制率可达72.064%;肾脏、心脏、肝脏、主动脉、及肾上腺组织在荧光显微镜下可见大量荧光表达。 结论:Ad5-AT1R-shRNA对SHR的AT1R可起到RNA干扰的作用,抑制AT1R的基因表达,并可起到明显的降压作用,是一种非常具有潜力的降压新策略。 实验二 腺病毒介导的AT1-shRNA对SHR左心室重构的影响 目的:观察以重组腺病毒为载体的血管紧张素Ⅱ—1型受体(AT1R)的短发夹环RNA(Ad5-AT1R-shRNA)通过RNA干扰作用对自发性高血压大鼠血压及大动脉和心室重构的影响。 方法:12只SHR随机分为2组,实验组和高血压对照组,另设6只WKY 为正常血压对照组,实验组经鼠尾静脉注射已构建好的Ad5-AT1R-shRNA,高血压对照组和正常血压对照组注射对照重组腺病毒(Ad5-EGFP),分别共注射两次,于注射前及注射后定时测量大鼠尾动脉收缩压(SBP),观察重复注射Ad5-AT1R-shRNA对SHR血压的影响,试验结束时称量大鼠体重、全心重量及二者的比值,生物学方法测量左室心肌羟辅胺酸含量及胶原蛋白含量,并结合透射电子显微镜观察心肌超微结构的改变。 结果:注射Ad5-AT1R-shRNA前实验组和高血压对照组血压均显著高于正常血压对照组(P<0.01),经二次注射后实验组血压都出现明显下降,且第二次注射后的降压效持续时间较第一次长,而高血压对照组和正常血压对照组均未出现明显的血压下降;实验组大鼠与高血压对照组比较体重无显著性差异(P>0.05),而全心重量和心重/体重有显著性差异(P<0.05);高血压对照组心肌羟辅胺酸含量及胶原蛋白含量较正常血压对照组升高(P<0.01),而实验组却低于高血压对照(P<0.05);透射电镜观察心肌超微结构显示,实验组与高血压对照组比较心肌细胞核膜较完整,肌原纤维清晰,排列较整齐,横纹清楚,心肌间质无明显的胶原纤维增生。 结论:重复给予Ad5-AT1R-shRNA对SHR可起到明显的降压作用,并能明显改善心室重构,主要是通过Ad5-AT1R-shRNA抑制AT1R的表达,从而减少了AT1在高血压病心肌重构过程中的作用。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R544.1

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