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《华中科技大学》 2006年
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人乳头瘤病毒导致子宫颈癌的分子生物学机制及其在免疫治疗方面的应用研究

徐茜  
【摘要】: 目的构建表达人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16型的衣壳蛋白L1基因的杆状病毒重组供体质粒pFast HTb-HPV16 L1,用该重组转移质粒转化含有杆状病毒的表达载体以构建Bacmid--HPV16 L1,感染昆虫细胞进行表达,并对其抗原性、安全性和诱导淋巴细胞功能的检测。 方法用PCR方法克隆HPV16 L1基因,测序鉴定后与线性化的pFast HTb进行连接为pFast HTb-HPV16 L1,使pFast HTb-HPV16 L1与DH10BAC感受菌进行转座重组,利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid-HPV16 L1克隆,提取Bacmid-HPV16 L1转染昆虫细胞Sf9获得有感染力的病毒,利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过显微镜观察、SDS—PAGE和电子显微镜检测表达情况。分别在家兔、大鼠和小鼠体内检测其安全性,在家兔和大鼠体内进行抗体诱导实验。 结果获得了重组HPV16 L1的杆状病毒,昆虫细胞能表达出分子量为77kDa左右的融合有组氨酸标签的目的蛋白;电子显微镜观察到病毒样颗粒的外观。病毒样颗粒对家兔、大鼠和小鼠体内重要器官和组织无毒害作用;能够在家兔和大鼠体内诱导特异性抗体。 结论HPV16 L1衣壳蛋白能在昆虫细胞中获得表达,具有良好的分子生物学活性研究和抗原性,为其作为预防HPV 16型感染的疫苗研制奠定了基础。目的 建立正常人角膜成纤维细胞原代培养和体外连续培养的模型,为肿瘤发 生发展机制的试验研究提供正常对照体细胞。方法组织块贴壁法分离人角 膜成纤维细胞,倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态,透射电镜进行超微结 构观察,并拍照记录;描绘生长曲线及流式细胞仪检测细胞的增殖特点;免 疫细胞化学方法检测培养细胞内波形蛋白、I型胶原蛋白和角蛋白的表达;染 色体核型分析鉴定细胞来源。 结果分离的成纤维细胞可在体外贴壁生长、 增殖,具有典型成纤维细胞的形态与结构。生长曲线和流式细胞学显示细胞 的生长具有增殖的规律性,在不同细胞周期中的分布符合正常二倍体细胞特 点。免疫细胞化学检测波形蛋白表达阳性,I型胶原阳性,角蛋白阴性:染色 体分析为46条,属正常人二倍体细胞核型。 结论分离培养所获得的人角 膜成纤维细胞可在体外稳定传代培养,可以为肿瘤发病机制研究和提供充足、 可靠的正常人二倍体基质细胞模型。目的:为探讨人乳头病毒16型E6E7蛋白的致癌机理,建立感染模型细胞,为研 究E6E7蛋白的在宫颈癌发生发展中的作用提供实验基础。 方法;应用基因重组技术构建含有绿色荧光蛋白的EGFP-HPV16 E6E7真核表达 质粒,通过脂质体介导将其转染入HPV阴性的宫颈癌细胞株C33A细胞和原代培 养的人成纤维细胞HFB,倒置荧光显微镜观察转染效果,Western blot检测E6、 E7蛋白的表达。 结果:酶切产物电泳鉴定结果显示含E6E7基因的重组质粒EGFP—HPVl6 E6E7构 建成功,并能在C33A细胞和人成纤维细胞HFB中表达绿色荧光蛋白和E6、E7蛋 白。 结论:将人乳头病毒16型E6E7基因转染至HPV阴性细胞内,可以建立病毒感染 细胞配对模型,为进一步研究E6、E7蛋白致癌机理提供实验基础。目的:为探讨人乳头病毒16型E6E7蛋白的致癌机理,检测乳头瘤病毒16型 E6E7蛋白感染配对模型细胞中血管生成相关因子的差异表达并探讨其意义。 方法:血管发生信号抗体矩阵试剂盒,抗原—抗体反应的方法检测细胞中血 管生成相关因子的差异表达。 结果:血管形成信号抗体矩阵显影结果显示在配对的细胞中,HPV 16 E6E7蛋 白阳性C33A细胞中有8种因子表达较原C33A细胞增高(Angiopoiein,FGF alpha,G-CSF,FGF beta、IL-6、IP-10和TGF alpha),有1种因子表达降 (HGF);HPV 16 E6E7蛋白阳性HBF细胞中有12种因子表达较HBF细胞增高 (Angiopoiein,IL-1 alpha,FGF alpha,G-CSF,IL-1 beta,IL-6,IL-8, TGF alpha,TIMP-1,TIMP-12,VEGF和PDGF),有2种因子表达降(IFN gamma 和Leptin);2对细胞有共同差异的因子有5种因子(Angiopoiein,FGF alpha, G-CSF,IL-6和TGF alpha)。 结论:人乳头病毒16型E6E7基因可以提高血管发生相关因子的表达,促进子 宫颈肿瘤的生长和转移。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R737.33

【参考文献】
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