体外循环肺损伤敏感基因筛选

【摘要】： 第一部分体外循环前后患者静脉血白细胞基因的差异性表达 研究背景与目的：急性肺损伤是体外循环的常见并发症，是全身性炎症反应综合征的早期表现。约有1％～2％的体外循环患者会发生严重的呼吸功能障碍，称为ARDS或泵后综合征。其病理生理特征是肺毛细血管内皮受损、微循环通透性升高、血管外肺水积聚、肺内分流增加，以及由此而引起的难治性低氧血症、呼吸功能衰竭以及其它系列临床表现，死亡率高达50％～70％。研究表明，体外循环期间，中性粒细胞在肺部的积聚、隔离和激活，是体外循环引起肺损伤的关键性因素。因此，本研究拟采用基因芯片技术，对体外循环前后血液中白细胞基因表达变化进行比较全面的研究，获得其差异性表达谱，分析其表达变化规律。以期从基因表达水平认识体外循环引起肺损伤的机制，提出新的防治策略。 方法：选择择期体外循环下行心内直视手术的患儿8例，分别在体外循环前和停机时采取血液标本5ml，提取总RNA。以总RNA为模板逆转录获取cDNA；然后以cDNA为模板体外转录得到生物素标记的cRNA，cRNA经提纯和片断化处理后与商业化的U133A基因芯片杂交。杂交后的芯片用专用激光共聚焦扫描仪采集荧光强度值，并用Affymetrix(?) Microarray Suite 5.0软件分析基因表达规律。 结果体外循环前表达开放的基因共有7023个，体外循环后表达开放的基因有7810个。分别占芯片上探针组总数的31.5％和35％，后者较前者增加了787个。与体外循环前相比，体外循环后共有2873个基因出现差异性表达，1390个增高，1483个降低；差异性变化在3倍以上的基因共有96个；通过检索，芯片上共有134条蛋白酶相关基因。其中，有9条在体外循环后出现了差异性表达，7条表达升高，2条表达降低。体外循环后中性粒细胞弹性蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制因子1～4基因均未发生显著变化。 结论：体外循环可引起人血白细胞基因出现明显的差异性表达，其特点与全身性炎症反应的临床认识相符；某些蛋白酶基因表达出现异常增高，且存在蛋白酶/抗蛋白酶基因表达比例失调。对这些现象进一步研究，有助于深入了解体外循环肺损伤的机制或提出新的治疗策略。 第二部分体外循环对心脏手术患者基质金属蛋白酶9的影响 研究背景和目的：基质金属蛋白酶9(MMP-9)是基质金属蛋白酶家族最重要的成员之一，它能特异性的降解Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白和明胶，破坏毛细血管基底膜和肺泡上皮基底膜的完整性。研究表明，MMP-9参与了多种原因引起的肺损伤。在第一部分的基础上，我们假设MMP-9在体外循环引起的急性肺损伤中也起着重要的作用。因此，本研究的目的是了解心脏直视手术患者体外循环前后MMP-9基因表达、血浆浓度和激活程度的变化。 方法：随机选择择期心内直视术成年病人20例和同期开胸行非心脏手术的病人8例，分别为体外循环组(体外组)和对照组。体外组患者于手术开始前、转流前和停机时采集血液标本，分别采用RT-PCR、酶联免疫和荧光酶联免疫法测定MMP-9基因表达强度、血浆总浓度和活性MMP-9浓度。对照组患者的采样时点为手术开始前、开胸后和关胸前，分别与体外组比较。指标检测方法与体外组一致。 结果：体外组患者于手术开始前和转流前MMP-9基因表达、血浆总浓度和活性MMP-9浓度比较差异均无统计学意义，但停机时基因表达明显增强，总MMP-9和活性MM-9血浆浓度升高(P＜0.01)。对照组各时点间上述指标均未发生显著性变化。组间比较时第一、第二时点各指标无统计学差异，但体外组停机时MMP-9基因表达，血浆总浓度和活性MMP-9浓度均明显高于对照组关胸前的测定值(P＜0.01)。 结论：体外循环可导致患者白细胞中MMP-9基因表达剧烈上调，血浆总MMP-9和活性MMP-9浓度也明显升高。但这种变化与开胸手术操作无关。 第三部分地塞米松对体外循环患者基质金属蛋白酶9和肺功能的影响 目的：研究地塞米松对心脏手术患者体外循环前后基质金属蛋白9的影响，并探讨其与肺功能之间的关系。 方法：择期行体外循环下心脏瓣膜置换术的成年患者40例，随机分为两组：对照组和地塞米松组，每组20例。地塞米松组患者于手术开始前给予地塞米松0.5mg/kg静脉注射，对照组给予等体积生理盐水。在手术开始前、转流前和停机后经中心静脉留置管取血液标本，分离乏血小板血浆和提取总RNA。分别采用酶免法和RT-PCR方法测定血浆总的和活性基质金属蛋白9浓度及基质金属蛋白9基因相对表达量。同时在体外转流前和停机后抽取桡动脉血行血气分析。计量资料用均数±标准差((?)±S)表示，采用SPSS 11.5软件行统计学分析，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果：停机后，两组患者基质金属蛋白9基因表达、血浆浓度和激活程度较手术开始前和转流前显著升高(P＜0.05或0.01)，但地塞米松组低于对照组(P＜0.05)。与转流前相比，停机后两组患者肺泡-动脉氧分压差均增大，但地塞米松组低于对照组(P＜0.05)。 结论：地塞米松0.5mg/kg静脉注射，能抑制体外循环引起的患者基质金属蛋白9基因表达、血浆浓度和激活程度升高，对肺泡弥散功能有保护作用。