骨形态发生蛋白-2诱导成骨过程中血管内皮生长因子的表达及意义

【摘要】： 第一部分骨形态发生蛋白-2诱导成骨过程中血管内皮生长因子的表达及分析 目的探讨骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)诱导成骨过程中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达情况,以加深对BMP-2诱导成骨机制的认识,为BMP-2的进一步临床应用奠定理论基础。 方法采用昆明鼠20只,外科手术建立股部肌袋诱导成骨模型,以左侧大腿为实验组,右侧为对照组。实验组肌袋内植入以明胶和羟基磷灰石复合物为载体的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)0.25mg;对照组仅植入空白载体。分别于术后3、7、14和21天取材,采用原位杂交和免疫组化方法检测VEGF mRNA及蛋白的表达情况。 结果术后3d可见大量间充质细胞聚集,胞浆出现VEGF的表达,但随着间充质细胞分化为前软骨细胞并不断成熟,VEGF在间充质细胞内的表达逐渐消失,而在成软骨细胞和软骨细胞内的表达水平迅速提高,VEGF在成熟软骨细胞中的表达最为活跃,至到新骨形成,在成骨细胞和骨细胞中仍可检测到VEGF的强烈表达;而对照组则未检测到VEGF的表达。 结论VEGF的表达贯穿BMP-2诱导成骨的全过程,并在成熟软骨细胞和成骨细胞呈现强烈表达;BMP-2具有促进VEGF合成与分泌的作用。尽管VEGF在这一过程中的意义尚不完全明确,但这对进一步阐明BMP-2诱导成骨的机制提供了新的思路,为BMP-2的进一步临床应用奠定了理论基础。 第二部分鼠胚成骨细胞的原代培养与鉴定 目的探讨一种经济、高效的原代成骨细胞培养方法,为进一步的实验研究奠定基础。 方法孕龄19d的KM小鼠,无菌条件下剖腹取出胎鼠,然后取胎鼠的颅盖骨,剔净、漂洗、剪碎。用0.25%胰蛋白酶消化10mmm,终止消化后将碎骨块接种于培养瓶中培养,通过相差显微镜、透射电镜观察,碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色和钙结节茜素红染色等方法对所获得细胞进行鉴定。 结果所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色、骨钙素染色和钙结节染色均呈阳性。 结论改良的组织块培养法可在较短时间内获得大量成骨细胞,所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。第三部分BMP-2促进鼠胚成骨细胞VEGF表达的剂量依赖性效应 目的通过不同剂量重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bonemorphogenetic protein-2,rhBMP-2)刺激原代培养的小鼠胚胎成骨细胞,探讨BMP-2对成骨细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。 方法取19d胎龄的小鼠胚胎颅骨成骨细胞进行体外培养,采用RT-PCR和Westernblot法分别检测不同浓度rhBMP-2对成骨细胞VEGF mRNA及蛋白表达的影响。 结果RT-PCR及Western blot法检测表明,VEGF mRNA及蛋白在原代成骨细胞内稳定表达;半定量分析证实,不同rhBMP-2剂量组间VEGF mRNA的表达量呈一定变化规律,随着rhBMP-2浓度的升高,VEGF mRNA的表达量逐渐增加,当rhBMP-2剂量为300 ng/ml左右时,VEGF mRNA的表达量最高,超过此剂量,VEGF的表达则有下降趋势。 结论VEGF可在原代鼠胚成骨细胞内稳定表达;rhBMP-2可促进VEGF在成骨细胞的表达,并呈一定的剂量依赖性关系,rhBMP-2剂量为300ng/ml左右时,其促进作用最佳。第四部分BMP-2促进鼠胚成骨细胞VEGF表达的时间依赖性效应 目的探讨BMP-2促进鼠胚成骨细胞VEGF表达的时间规律。 方法取19d胎龄的小鼠胚胎颅骨成骨细胞进行体外培养,采用RT-PCR法分别检测不同作用时间下rhBMP-2(300 ng/ml)对成骨细胞VEGF mRNA表达的影响。 结果RT-PCR法检测表明,应用相同剂量rhBMP-2(300 ng/ml)刺激成骨细胞时,不同作用时间下VEGF mRNA的表达量不同,呈双时相,分别在3h和24h时出现峰值,48h时VEGF mRNA的表达仍保持较高水平。减除各自对照组的影响,各时间点VEGF表达的相对值([rhBMP-2组/对照组]比值)亦呈时间依赖性关系,6h时明显升高,约为对照组的2.6倍(P0.05)。VEGF mRNA的第2个峰值出现在大约36h左右,约为对照组的2倍。48h时,VEGF mRNA的相对水平仍然保持较高水平。 结论rhBMP-2对VEGF表达的促进作用呈时间依赖关系,分别在3h和24h时出现峰值,48h时VEGF mRNA的表达仍保持较高水平。减除各自对照组的影响,各时间点VEGF表达的相对值(rhBMP-2组/对照组)亦呈时间依赖性效应,两个峰值分别出现在6h或36h左右。 第五部分BMP-2促进鼠胚成骨细胞VEGF表达的机制研究 目的探讨重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogeneticprotein-2,rhBMP-2)促进鼠胚成骨细胞血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)表达的机制。 方法取19d胎龄的小鼠胚胎颅骨成骨细胞进行体外培养,在加入rhBMP-2诱导成骨的同时,分别加入放线菌素D、放线菌酮和羟(基)脲等三种药物,RT-PCR法检测VEGF mRNA表达的变化。 结果应用放线菌素D阻断基因转录后,可降低对照组成骨细胞VEGF mRNA的表达,并可完全抑制BMP-2对VEGF表达的促进作用。用放线菌酮阻断成骨细胞的蛋白合成后,可增加对照组成骨细胞VEGF mRNA的表达,但并不能完全抑制BMP-2对VEGF mRNA表达的促进作用。应用羟(基)脲阻断DNA合成后,可抑制BMP-2对VEGF分泌的促进作用。 结论rhBMP-2对鼠胚成骨细胞VEGF基因表达的促进作用,主要通过促进VEGF mRNA的转录,并与BMP-2的促有丝分裂活性密切相关,新蛋白的合成并不是促进VEGF mRNA表达的必要条件。第六部分血管内皮生长因子在BMP-2诱导成骨细胞过程中的作用 目的探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)诱导成骨过程中的作用。 方法(1)取小鼠胚胎成骨细胞进行体外培养,RT-PCR法检测rhBMP-2(300ng/ml)诱导成骨细胞分化过程中VEGF受体(VEGF receptors,VEGF-R)的表达。(2)采用VEGF反义寡核苷酸和苏拉明分别阻断VEGF的合成及功能,观察对成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase activities,AP)活性和钙结节形成的影响。(3)在rhBMP-2诱导成骨的同时,添加不同浓度的外源性VEGF,观察对成骨细胞体外矿化能力的影响。 结果(1)RT-PCR法可检测到VEGF-R(Flk-1和Flt-1)mRNA在成骨细胞呈稳定弱表达,rhBMP-2干预24h后VEGF-R的表达量无明显变化。(2)应用VEGF反义寡核苷酸(VEGF antisense oligodeoxynucleotides,VEGF ASODNs)和苏拉明阻断VEGF的合成和功能后,可抑制rhBMP-2所诱导的AP活性和钙结节形成,并存在剂量依赖效应。(3)用不同浓度的VEGF干预成骨细胞发现,单独VEGF并不能使成骨细胞分化为钙结节,外源性VEGF的加入亦不影响rhBMP-2刺激钙结节形成的能力。 结论VEGF在成骨细胞可以自分泌的形式发挥作用,VEGF至少部分参与了rhBMP-2的诱导成骨活性。有关VEGF在BMP-2诱导成骨过程中更为明确的作用或机制,有待进一步研究。