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丙型肝炎病毒核酸国家标准物质的研究

王露楠  
【摘要】: 背景和目的 丙型肝炎病毒核酸(HCV RNA)检测缺乏统一的定量标准,给临床的诊断和治疗带来了很多问题。研制国内用于HCV RNA扩增检测的血清标准物质,推进核酸检测的标准化。构建原核表达系统,表达内含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒样颗粒,该病毒样颗粒所含的HCV部分核酸序列因被噬菌体衣壳蛋白包裹而具有耐核糖核酸酶(RNase)特性。替代冻干血清的标准品,使其具有更好的临床适用性。 方法 1、选择HCV阳性血浆,用荧光定量PCR检测试剂进行初步检测,再用阴性的献血员血浆,除纤维蛋白原(纤原)后进行稀释。采用国际公认的PCR内标定量方法,即ROCHE公司COBAS AMPLICOR及相应试剂进行检测,以WHO标准品(NIBSC编号96/790)进行比对定值。 2、将该定值制备物发放给HCV RNA荧光定量试剂的生产厂家进行检测。 3、由于HCV分型和HCV RNA定量检测试剂盒,所检测的区域主要集中在5'-UTR区,因此本研究拟选用5'-UTR区作为MS2噬菌体的包装序列。引物5'端引入HindⅢ酶切位点。PCR产物进行T载体克隆后用限制性内切酶HindⅢ酶切获得所需要的目的片段,与用HindⅢ酶切的表达载体pNCCL1相连接,构建一新的表达载体pNCCL1-HCV。在IPTG诱导下,衣壳蛋白会在携带有pET-MS2-HCV的细菌中表达,并与reRNA组装成病毒样颗粒。诱导后的细菌经超声碎菌,离心后即可得到含病毒样颗粒的上清。为验证包装的核酸为HCV reRNA,取20μl上清按1∶10至1∶10~6比例稀释后,依照异硫氰酸胍盐提取RNA的方法提取VLPs的RNA,然后进行RT-PCR。取20μl所得到的上清,加入RNaseA(100U)和DNaseI(20U),37℃,温育4天以观察病毒样颗粒的稳定性。将病毒样颗粒用PEG6000沉淀后,加入正常人阴性血清,取20μl于45℃放置3天观察病毒样颗粒是否适合运输。 结果 HCV RNA含量为(1.29±0.24)×10~5IU/ml,瓶间差异为3.53%。两种标准物质的稳定性为:室温可稳定两周以上;37℃可稳定一周以上;2-8℃可稳定6个月以上。-20℃可稳定两年以上。2005年获得国家技术监督局批准的标准物质证书,编号为GBW(E)090032。按照中国标准物质委员会相关要求进行了稳定性及均一性试验,结果均符合要求。第二部分的研究中成功构建得到了质粒驱动的包装系统,经原核表达得到了内含HCV reRNA的病毒样颗粒。该病毒样颗粒的浓度大于10~(10)拷贝/ml。病毒样颗粒包装的reRNA耐受核糖核酸酶。病毒样颗粒在37℃,有RNase A和DNase 1消化的情况下,放置4d,病毒样颗粒依然保持稳定;将病毒样颗粒用PEG6000沉淀后,加入正常人阴性血清,于45℃放置3d,稳定性良好。 结论 第一部分研究获得的定值冻干血清是我国第一个用于核酸检测的标准品。由于该标准物质基质为冻干血清,含有完整的病毒核酸序列,与临床检测的病人标本一致,具有很好的临床适用性。推广范围包括各个HCV RNA检测试剂生产厂家、医院临床基因扩增检验实验室及进行核酸筛查的血站等。该标准物质,在国内主要PCR检测试剂的生产厂家均得到了应用,在稳定性及定值的准确性方面得到了充分肯定。由该标准物质传递的血清基质的标准曲线,由于血清基质的标准曲线同待测样本一样经过纯化和逆转录步骤,消除了标准品与样本间提取效率和逆转录效率检测差异,同时消除了不同试剂不同人员操作间的差异,又具有溯源性,使检测结果准确并具有可比性,因此该标准物质在临床基因扩增定量检测HCV RNA方面有广阔的应用前景,将有力的促进临床HBV DNA和HCV RNA定量检测的标准化。第二部分研究得到的表达载体pET-MS2-HCV及原核表达系统,可以作为构建和制备耐RNase的HCV RNA标准品和质控品的平台。获得了HCV 1b、2a、6a型三种基因型病毒样颗粒。该病毒样颗粒可以直接作为作为冻干血清标准物质的替代品,也可以做HCV核酸测定中的阳性质控物和某些HIV RNA外标定量测定的外标定量标准:还可以为HCV RT-PCR检测试剂盒和实验室室间质量评价提供无生物传染危险性的样本。如果对pET-MS2-HCV中的HCV检测的目的片段进行缺失、插入和突变等修饰,所获得的病毒样颗粒可以作为HCV定量测定中的内标标准和HCV RT-PCR测定的内标质控物。


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