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《华中科技大学》 2006年
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稳定表达EGFR细胞系的建立及其抗EGFR单链抗体的筛选与鉴定

赵晓蓉  
【摘要】: 第一部分稳定表达EGFR-GFP融合蛋白细胞系的建立 目的建立膜表面稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系,为后续研究奠定基础。 方法采用CaCl_2法将pEGFR-EGFP质粒转化大肠杆菌DH5α,酶切鉴定后提取质粒经电穿孔转染CHO-K1细胞;以EGFP作为荧光报告分子,克隆化培养以获取单克隆阳性细胞;流式细胞术、荧光显微镜术、Western Blot检测转染细胞EGFR-GFP融合蛋白的表达;反复冻存、复苏、传代鉴定细胞表达EGFR-GFP融合蛋白的稳定性。 结果①转染后,经G418筛选14天,克隆化培养,共获得2株稳定转染的单克隆细胞,分别命名为CHO-EGFR-GFP1、CHO-EGFR-GFP2;②经流式细胞仪检测,CHO-EGFR-GFP1细胞GFP、PE双标记阳性率达92%以上,说明EGFR-GFP融合蛋白主要表达于细胞膜上,CHO-EGFR-GFP2细胞GFP检测阳性率较高,但PE标记阳性率较低,提示融合蛋白主要表达于细胞内;③倒置相差荧光显微镜观察可见CHO-EGFR-EGFP1主要表现为细胞膜绿色荧光,能与PE标记的anti-human-EGFR结合,CHO-EGFR-EGFP2细胞主要呈现细胞内绿色荧光,不与PE标记的anti-human-EGFR结合,与流式细胞仪检测结果一致;④Western blot分析CHO-EGFR-GFP1细胞裂解液可见分子量约166 kDa条带;⑤CHO-EGFR-EGFP1细胞经反复冻存、复苏,证明EGFR-GFP融合蛋白能稳定表达,表明成功建立稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系,为研究EGFR与其配体间相互作用以及筛选靶向EGFR的单链抗体奠定了基础。 第二部分EGF对CHO-EGFR-GFP1细胞生物学特性的影响 目的对于大多数细胞而言,EGFR与其配体EGF相互作用往往促进其增殖,但对于某些细胞,EGF且相反地抑制其增殖。本部分研究拟以所建立的膜表面表达全长EGFR与GFP融合蛋白的细胞系CHO-EGFR-GFP1为模型,进一步研究EGF与EGFR之间相互作用。 方法通过细胞计数,绘制生长曲线,比较稳定转染细胞及未转染细胞的生长情况;台盼蓝染色计数活细胞数观察不同浓度EGF刺激48h后细胞增殖情况;PI染色一步法流式细胞仪检测不同浓度EGF刺激48h和100ng/ml EGF刺激不同时间细胞周期改变以及细胞凋亡情况,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡情况;流式细胞术测定GFP平均荧光强度、Western blot检测及倒置荧光显微镜观察判定EGFR表达水平的变化。 结果以建立的膜表面表达全长EGFR与GFP融合蛋白的细胞系CHO-EGFR-GFP1为细胞模型,研究EGF与EGFR之间的相互作用。研究结果表明:①在不加入EGF的培养体系中,CHO-EGFR-GFP1、CHO-EGFR-GFP2细胞与未转染CHO-K1细胞生长特性无显著差异,在保证培养条件、接种细胞数、观察时间基本一致的情况下,各细胞增殖速度接近,说明表达的融合蛋白对细胞没有明显毒性;②在培养体系中,加入低浓度的EGF可促进CHO-EGFR-GFP1细胞增殖,而在高浓度EGF培养体系中则引起CHO-EGFR-GFP1细胞失去粘附、细胞周期阻滞、促进细胞凋亡以及抑制细胞增殖;③EGF对细胞增殖的影响与EGFR表达水平密切相关,高浓度EGF以一种剂量依赖性的方式同时上调EGFR的表达和引起细胞凋亡;④EGF刺激对CHO-K1及CHO-EGFR-GFP2细胞生长无明显作用。 第三部分EGFR特异性内吞性单链抗体的筛选与鉴定 目的利用抗体将治疗分子(毒素、治疗基因)直接运送到肿瘤细胞内发挥作用是一种重要的肿瘤靶向治疗策略。本研究拟从大型人源抗体库Griffin 1中直接筛选出靶向EGFR并能够触发其内吞的单链抗体,为研究靶向EGFR的抗肿瘤治疗药物奠定基础。 方法以稳定转染的CHO-EGFR-GFP1细胞和未转染的CHO-K1细胞分别作为阳性和阴性细胞,采用负筛选的方法,洗去与细胞表面结合的噬菌体,裂解细胞获取内吞性的噬菌体用于下一轮筛选;通过比较每轮投入及洗脱出噬菌体的效价比以及细胞ELISA检测多克隆p-scFv与阳性、阴性细胞结合情况对筛选过程进行监测;采用菌落PCR挑选含有全长scFv片断的菌落,进一步用FCM检测单克隆p-scFv与天然表达EGFR细胞及EGFR阴性细胞结合情况;挑选EGFR特异性单克隆p-scFv采用DNA测序法确定克隆多样性;原核表达EGFR特异性s-scFv采用FCM检测其与天然表达EGFR细胞及EGFR阴性细胞结合百分率,采用Western blot检测其与EGFR阳性细胞及阴性细胞裂解液结合的差异,倒置荧光显微镜观察s-scFv是否被内吞入EGFR阳性细胞。 结果经过5轮筛选,细胞裂解液中洗脱出噬菌体效价有500倍以上提高,而细胞表面结合噬菌体效价仅有15倍增长,说明内吞性p-scFv得到富集;细胞ELISA结果显示多克隆p-scFv与CHO-EGFR-GFP1细胞和CHO-K1细胞均有明显结合,但与前者结合高于后者,说明所获多克隆p-scFv大多数针对两种细胞表面共同抗原,但有部分特异性结合EGFR;菌落PCR显示约45%克隆中含有完整的1kb scFv片断;共挑取300个菌落,经菌落PCR、细胞ELISA、FCM检测,共得到4株EGFR特异性scFv,DNA测序结果显示4株DNA序列仅一株有个别碱基不同,但均能翻译成同样的氨基酸系列,因此将其统一命名为F4-scFv,F4-scFv可与天然表达EGFR的细胞特异性结合并能触发受体介导的内吞作用,但不与EGFR阴性细胞结合;Western blot检测F4-scFv可识别EGFR特异性条带。F4-scFv可被用作载体运送治疗药物进入肿瘤细胞,而且由于其人源性,对人将无免疫原性。在筛选和鉴定过程中采用表达GFP标记的受体的转染细胞作为阳性细胞,不用表达、纯化受体蛋白用于筛选和检测,可保证所筛选的抗体能与天然受体结合,加快了获取靶向抗体的进程。 结论成功建立膜表面稳定表达EGFR-GFP的细胞系CHO-EGFR-GFP1;首次在同一种因不同浓度EGF刺激而表达不同水平EGFR的细胞中观察到EGF对细胞增殖的影响与EGFR表达水平的关系。高浓度EGF刺激引起肿瘤细胞失去粘附可能是导致肿瘤细胞容易脱落,发生转移的机制之一;进一步以CHO-EGFR-GFP1为阳性细胞,未转染CHO-K1细胞为阴性细胞,采用负筛选方法,从大型人源抗体库中筛选得到EGFR特异性能够触发受体内吞的单链抗体F4-scFv,F4-scFv可用于运载治疗性物质进入高表达EGFR的肿瘤细胞,为进一步研究靶向EGFR的抗肿瘤治疗药物奠定了基础。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R392

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