维生素C对三氧化二砷诱导肝癌细胞和正常肝细胞凋亡的作用研究

【摘要】： 三氧化二砷(As_2O_3)系中药砒霜的主要成分,其药用历史悠久。长期以来,砷制剂无论在东西方都被认为属于剧毒物质,并有致癌,致畸及致突变作用。然而作为“以毒攻毒”的典型代表药物,我国自古就有应用砒霜等砷类中药治疗包括肿瘤在内的多种恶性疾患的记载,近年来国内外应用As_2O_3治疗白血病也已取得令人瞩目的进展。维生素C(AA),传统的抗氧化剂,却在体外实验中发现能促进As2O3对血液系统恶性肿瘤的氧化作用,从而促进凋亡[1-3],其是否同样能促进As2O3对肝癌的作用?本实验将对该问题作初步探讨,并通过比较对正常肝细胞的抑制率影响作用,对其安全性作初步评价。 一细胞培养及形态学实验 目的:体外培养人肝癌细胞HepG2及正常肝细胞L-02,探讨AA对As_2O_3诱导培养人肝癌细胞生长抑制的促进作用。方法:体外培养正常人肝细胞株L-02及肝癌细胞株HepG2,采用台盼兰拒染法测定细胞存活率,四甲基偶氮唑蓝MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑, 5.0 mg/mL)法测定细胞抑制率。 结果:As2O3 (2.0μmol/L)和AA(50μmol/L)联用比单用As2O3活细胞数显著减少;AA(50μmol/L)能明显促进As2O3 (2.0μmol/L)对肝癌细胞的生长抑制:药物处理24小时后,单用As2O3 (2.0μmol/L)组细胞生长抑制率为(23.36±0.92)%,联用组As2O3 (2.0μmol/L)+ AA (50μmol/L)为(43.95±1.56)% (P0.01),且强于单用As2O3 (4.0μmol/L)组的(41.45±1.10)%(P0.05)。 结论:AA能促进As2O3抑制人肝癌细胞HepG2生长的能力,使其抑制率增高,活细胞减少。 二细胞凋亡检测及周期分析 目的:检测AA对As_2O_3诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的促进作用,并对细胞周期进行分析 方法:Annexin-V/PI双染色流式细胞术测定凋亡率以评价不同浓度As_2O_3,AA单独或者联合应用对细胞凋亡的作用;PI单染法测定细胞周期改变情况。 结果:AA(50μmol/L)能明显促进As_2O_3 (2.0μmol/L)诱导肝癌细胞凋亡:单用As_2O_3 (2.0μmol/L)组细胞凋亡率为(11.37±1.20)%,而联用组As2O3 (2.0μmol/L)+ AA(50μmol/L)为(16.06±0.86)%(P0.01)。细胞周期分析显示AA和As_2O_3联用能有效的增强细胞周期的S期聚集,从而增强促细胞凋亡作用。结论:AA能促进As2O3诱导人肝癌细胞HepG2凋亡。 三药物安全性评价 目的:测试As2O3和AA联合应用对培养正常人肝细胞的作用。 方法:体外培养正常人肝细胞株L-02及肝癌细胞株HepG2,采用四甲基偶氮唑蓝MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑, 5.0 mg/mL)法测定细胞抑制率并对两者进行比较。 结果:药物处理48小时,单用As_2O_3 (2.0μmol/L)组细胞生长抑制率为(36.54±0.82)%,联用组As_2O_3 (2.0μmol/L)+ AA(50μmol/L)为(51.98±1.52)% (P0.01),显著性强于阳性药5-Fu的(37.32±1.29)%及单用As2O3 (4.0μmol/L)组的(45.27±1.96)%(P0.01)。然而诱导正常人肝细胞凋亡作用,联用组(As2O3 2.0μmol/L+ AA 50μmol/L)为(19.85±0.88)%弱于5-FU组的(33.73±2.79)%和As2O3 (4.0μmol/L)组的(22.15±3.50)%。 结论:AA能促进As2O3诱导人肝癌细胞HepG2的抑制,且不平行增加正常肝细胞株的凋亡。