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《华中科技大学》 2006年
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抗TfR单链抗体及其双价抗体的构建、表达及鉴定

肖代雯  
【摘要】: 目的抗转铁蛋白受体单链抗体及其双价抗体(BsFv)的构建,表达及其与细胞结合的活性与特异性鉴定。 方法 1.通过酶切与亚克隆构建抗转铁蛋白受体单链抗体(scFv); 2.以抗转铁蛋白受体scFv为模板,设计引物引入中间连接肽(G4S)及酶切位点AscI,通过PCR方法扩增出两个scFv片段,将其连接,并克隆至原核表达载体pAB1,将其转化大肠杆菌TG1,挑取单克隆细菌进行扩增,提取质粒酶切、测序鉴定; 3.IPTG诱导单链抗体及其双价抗体表达,Ni-NTA层析柱纯化抗体,收集纯化产物经SDS-PAGE分析,Western blot鉴定; 4.通过FCM测定纯化单链抗体及其双价抗体与细胞结合特异性与活性。 结果 1.随机挑选转化板上的菌落提取质粒,SfiI、NotI酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见一条约750bp和1500bp的阳性条带,分别与单链抗体和双价抗体基因大小理论值符合。双价抗体测序结果与原单链抗体以及PCR引物比对正确。证明抗TfR单链抗体和双价抗体构建成功,并均已克隆至分泌性表达载体pAB1中; 2.IPTG诱导单链抗体及其双价抗体表达,可溶性蛋白纯化后经SDS-PAGE分析,Western blot检测,可见约30KD和60KD大小的条带,分别与单链抗体和双价抗体理论值一致; 3.将纯化的单链抗体,双价抗体分别与K562,HepG2,静止外周血淋巴细胞进行结合,FCM检测与细胞结合的阳性率结果显示,双价抗体与K562结合的阳性率约60%左右,与HepG2结合的阳性率为23%左右,高于单链抗体,且单链抗体,双价抗体与静止外周血淋巴细胞结合阳性率基本一致。表明构建的抗转铁蛋白受体单链抗体与双价抗体均具有与K562及Hela细胞表面TfR结合的特异性,双价抗体亲合力较单链抗体有所提高。 结论成功构建与表达抗TfR的单链抗体与双价抗体,并证明其具有与K562,HepG2细胞表面TfR结合的活性及特异性,双价抗体亲合力较单链抗体有所增强。.为抗TfR的单链抗体与双价抗体用于细胞表面TfR与可溶性TfR的检测,以及靶向研究奠定了基础。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R392

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【参考文献】
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