重组腺相关病毒介导人激肽释放酶基因治疗慢性肾功能不全及其机制研究

【摘要】： 目的组织激肽释放酶-激肽系统在心血管和肾脏功能的调节中起着重要的作用,它是肾脏循环的主要调节因子之一。多种伴有进行性肾脏损害的高血压大鼠模型的研究结果显示,导入组织型激肽释放酶基因对高血压诱导的肾脏损害有明显的保护作用。但激肽释放酶基因对慢性肾功能不全的治疗作用目前国内外尚未见报道。为探讨激肽释放酶基因对慢性肾功能不全的治疗作用及可能的作用机理,本实验在我们实验室原有的工作基础上,首次将重组腺相关病毒载体介导的人组织型激肽释放酶基因导入慢性肾功能不全(5/6肾切除诱导)的大鼠模型体内,观察它对大鼠肾脏功能和形态的影响以及对肾组织BK-B2、多巴胺D1、血管紧张素ⅡAT1、内皮素ETA、血管加压素V2受体的mRNA表达水平和B2受体的蛋白表达水平的调节作用。在细胞水平观察缓激肽对缓激肽B2受体基因表达的调节作用,同时对其相关的信号传导通路进行初步的探讨。 方法和结果 一、在体实验:将人组织型激肽释放酶基因(human tissue kallikrein gene-HK)克隆入重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus-mediated-rAAV)载体中,经pXX2,pXX6和pXXUF1-HK三质粒共转染方法在293细胞中包装成rAAV-HK病毒,并用同样的方法包装含基因GFP的rAAV-GFP病毒,以斑点杂交方法检测其病毒滴度。雄性wistar大鼠24只,随机分为二组,伪手术组(Sham Op组)6只、模型组18只。按照Hinojosa-Labord的方法,适当改良构建慢性肾功能不全的大鼠模型。采用二期手术方案。一期手术,切除左肾上下极各1/3的肾组织。一周后行二期手术,摘除右肾。Sham Op组同样经受两期手术,剥离肾脏,但保留双肾的完整性。模型构建完成后一月,模型组18只大鼠再随机分成三组:单纯手术组(Op only组)6只,不给予病毒注射;对照组(GFP组)6只:每只单次尾静脉注射1×1011p.f.u.的rAAV-GFP病毒;实验组(HK组)6只:每只单次尾静脉注射1×1011p.f.u.的rAAV-HK病毒。于模型构建前、构建后15天和一月(基因转染前)、基因转染后1-3月各测大鼠尾动脉血压(处死大鼠前通过颈动脉有创测量血压一次)及采集大鼠的血液、24小时尿标本一次,血标本及时送院检验科测定血清肌酐水平,尿标本经离心后放置于-80℃冻存,随后分别通过ELISA和冰点下降法检测24h尿微量白蛋白和尿渗透压。基因转染后3月,断颈处死大鼠,取其心、肝、大动脉和肾脏等主要脏器提取总RNA及蛋白质,经RT-PCR、Western Blot以及ELISA方法证实HK mRNA和蛋白在实验组大鼠各组织器官中的表达。四组大鼠的肾组织切片行HE和PAS染色,半定量方法评估肾小球硬化程度。采用实时RT-PCR和Western Blot技术,检测多种与肾脏功能调节相关的血管活性物质受体(receptor-R)如缓激肽B2、多巴胺D1、血管紧张素ⅡAT1、血管加压素V2以及内皮素ETA受体的mRNA和B2受体蛋白在各组大鼠肾组织中的表达水平。实验结果显示:⑴经尾静脉注射途径导入慢性肾功能不全的大鼠模型体内的rAAV-HK,经RT-PCR、Western Blot和ELISA方法证实,能够在大鼠的心脏、大血管、肾脏和肝脏等脏器中持久稳定表达3个月之久。⑵基因转染后1月,GFP组大鼠血压与Op only组相比无明显变化(190±17mmHg vs186±10mmHg n=6 ,p0.05 ); HK组大鼠的血压较Op only组明显下降(162±9mmHg vs186±10mmHg,n=6 ,p0.001)。3月后, GFP和Op only组大鼠血压一样继续增加;而HK组大鼠血压维持在一月时的水平,未继续上升仍明显低于Op only和GFP组(163±13 mmHg vs217±16 mmHg vs220±13 mmHg n=6 ,p0.001)。⑶基因转染后1月,HK组大鼠血清肌酐水平与Op only组和GFP组相比无明显变化。2月时,GFP和Op only组大鼠血清肌酐水平继续增加; HK组大鼠血清肌酐水平未进一步升高,但与Op only组相比无统计学差异。3月后, GFP和Op only组的大鼠血清肌酐水平一样持续增加;HK组大鼠血清肌酐水平与2月时相比仍无明显变化,但明显低于Op only和GFP组(58.9±12.3 umol/L vs 133.3±13.5 umol/L vs 127.8±20.33 vs umol/L , n=6 , p0.001)。⑷基因转染后3月,HK组大鼠的24h尿微量白蛋白较GFP和Op only组明显降低(6.95±0.83 mg/24h vs 13.35±1.12mg/24h vs 12.85±1.54 mg/24h ,n=5 ,P0.05);尿渗透压较GFP和Op only组明显升高(589.3±74.1 Osmd/Kg vs 433.3±81.1 Osmd/Kg vs 413.5±68.2 Osmd/Kg ,n=5 ,P0.05)。⑸肾脏病理分析结果显示,GFP和Op only组大鼠的肾组织肾小球显著代偿肥大,系膜增生,球囊明显增厚,系膜区PAS阳性物质不同程度沉着,肾小球周围的肾小管腔也显著扩张,还可见肾小球节段性硬化,部分肾小球坏死。但HK组大鼠的肾组织仅见着色加深,肾小球已无明显代偿性肥大,肾小球周围的肾小管腔也无明显扩张。HK组大鼠的肾小球硬化指数及肾小球面积、PAS阳性面积和细胞数与Op only和GFP组相比均明显减少(P0.05)。⑹实时RT-PCR结果显示:B2R、D1R mRNA的表达水平在HK组明显高于Op only(P0.05);而GFP组和Op only组相比无明显的变化。AT1R、V2R、ETAR mRNA的表达水平则正相反,在HK组明显低于Op only组(P0.05);GFP组和Op only组相比也无明显的变化。说明HK基因转染后能够使慢性肾功能不全的大鼠肾组织B2R、D1RmRNA的表达水平明显上调,尤其是B2R水平;而使慢性肾功能不全的大鼠肾组织AT1R、V2R、ETAR mRNA的表达水平则下调。⑺Western Blot结果显示,在HK组B2受体蛋白的表达水平也明显高于Op only组(P0.05);GFP组与Op only组相比无明显的变化。说明HK基因转染后也能够使慢性肾功能不全的大鼠肾组织B2R蛋白的表达水平明显上调。更进一步在蛋白水平证实HK基因能够明显上调慢性肾功能不全的大鼠肾组织B2R的表达水平。 二、细胞实验:用BK、B2受体拮抗剂(HOE-140)及MAPK抑制剂(apigenin)、PI3K抑制剂(LY294002)和PKC抑制剂(H7)干预培养的人胚肾上皮细胞(293细胞),采用实时RT-PCR技术检测293细胞B2受体mRNA的表达水平;并进一步用Western Blot方法检测BK和HOE-140对细胞信号转导分子MAPK的磷酸化水平和PI3K蛋白表达水平的影响。实验结果显示:⑴BK明显上调293细胞B2受体mRNA的表达。⑵Apigenin和LY294002能够明显抑制BK对B2受体mRNA表达的上调,而H7不抑制BK对B2受体mRNA表达的上调。⑶BK刺激293细胞后,细胞MAPK磷酸化水平和PI3K蛋白的表达水平明显上调,HOE能够抑制其上调效应。 结论1、重组腺相关病毒载体介导的人组织型激肽释放酶基因能够在慢性肾功能不全(切除5/6肾脏诱导)的大鼠模型体内稳定持久表达3月之久。2、组织型激肽释放酶基因不仅能够明显降低慢性肾功能不全大鼠的血压,改善肾脏功能,而且明显减轻肾小球的硬化程度,显示出对慢性肾功能不全确切的治疗作用。3、组织型激肽释放酶基因治疗慢性肾功能不全的作用机制可能是它增强慢性肾功能不全的肾组织的激肽释放酶基因的表达,增加肾脏BK的产生,上调肾组织对肾脏功能调节有益的缓激肽B2受体基因和多巴胺D1受体mRNA的表达,下调肾组织对肾脏功能调节不利的血管紧张素ⅡAT1、内皮素ETA和血管加压素V2受体mRNA的表达。从而提升肾脏的抗损伤能力,拮抗肾脏的损伤效应有关。4、体外实验进一步证实,BK能够明显上调293细胞B2受体mRNA的表达。初步结果显示BK上调B2受体mRNA的表达可能与MAPK和PI3K/AKT信号传导途径有关。

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R692.5