收藏本站
《华中科技大学》 2006年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

重组腺相关病毒介导人激肽释放酶基因治疗慢性肾功能不全及其机制研究

涂玲  
【摘要】: 目的组织激肽释放酶-激肽系统在心血管和肾脏功能的调节中起着重要的作用,它是肾脏循环的主要调节因子之一。多种伴有进行性肾脏损害的高血压大鼠模型的研究结果显示,导入组织型激肽释放酶基因对高血压诱导的肾脏损害有明显的保护作用。但激肽释放酶基因对慢性肾功能不全的治疗作用目前国内外尚未见报道。为探讨激肽释放酶基因对慢性肾功能不全的治疗作用及可能的作用机理,本实验在我们实验室原有的工作基础上,首次将重组腺相关病毒载体介导的人组织型激肽释放酶基因导入慢性肾功能不全(5/6肾切除诱导)的大鼠模型体内,观察它对大鼠肾脏功能和形态的影响以及对肾组织BK-B2、多巴胺D1、血管紧张素ⅡAT1、内皮素ETA、血管加压素V2受体的mRNA表达水平和B2受体的蛋白表达水平的调节作用。在细胞水平观察缓激肽对缓激肽B2受体基因表达的调节作用,同时对其相关的信号传导通路进行初步的探讨。 方法和结果 一、在体实验:将人组织型激肽释放酶基因(human tissue kallikrein gene-HK)克隆入重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus-mediated-rAAV)载体中,经pXX2,pXX6和pXXUF1-HK三质粒共转染方法在293细胞中包装成rAAV-HK病毒,并用同样的方法包装含基因GFP的rAAV-GFP病毒,以斑点杂交方法检测其病毒滴度。雄性wistar大鼠24只,随机分为二组,伪手术组(Sham Op组)6只、模型组18只。按照Hinojosa-Labord的方法,适当改良构建慢性肾功能不全的大鼠模型。采用二期手术方案。一期手术,切除左肾上下极各1/3的肾组织。一周后行二期手术,摘除右肾。Sham Op组同样经受两期手术,剥离肾脏,但保留双肾的完整性。模型构建完成后一月,模型组18只大鼠再随机分成三组:单纯手术组(Op only组)6只,不给予病毒注射;对照组(GFP组)6只:每只单次尾静脉注射1×1011p.f.u.的rAAV-GFP病毒;实验组(HK组)6只:每只单次尾静脉注射1×1011p.f.u.的rAAV-HK病毒。于模型构建前、构建后15天和一月(基因转染前)、基因转染后1-3月各测大鼠尾动脉血压(处死大鼠前通过颈动脉有创测量血压一次)及采集大鼠的血液、24小时尿标本一次,血标本及时送院检验科测定血清肌酐水平,尿标本经离心后放置于-80℃冻存,随后分别通过ELISA和冰点下降法检测24h尿微量白蛋白和尿渗透压。基因转染后3月,断颈处死大鼠,取其心、肝、大动脉和肾脏等主要脏器提取总RNA及蛋白质,经RT-PCR、Western Blot以及ELISA方法证实HK mRNA和蛋白在实验组大鼠各组织器官中的表达。四组大鼠的肾组织切片行HE和PAS染色,半定量方法评估肾小球硬化程度。采用实时RT-PCR和Western Blot技术,检测多种与肾脏功能调节相关的血管活性物质受体(receptor-R)如缓激肽B2、多巴胺D1、血管紧张素ⅡAT1、血管加压素V2以及内皮素ETA受体的mRNA和B2受体蛋白在各组大鼠肾组织中的表达水平。实验结果显示:⑴经尾静脉注射途径导入慢性肾功能不全的大鼠模型体内的rAAV-HK,经RT-PCR、Western Blot和ELISA方法证实,能够在大鼠的心脏、大血管、肾脏和肝脏等脏器中持久稳定表达3个月之久。⑵基因转染后1月,GFP组大鼠血压与Op only组相比无明显变化(190±17mmHg vs186±10mmHg n=6 ,p0.05 ); HK组大鼠的血压较Op only组明显下降(162±9mmHg vs186±10mmHg,n=6 ,p0.001)。3月后, GFP和Op only组大鼠血压一样继续增加;而HK组大鼠血压维持在一月时的水平,未继续上升仍明显低于Op only和GFP组(163±13 mmHg vs217±16 mmHg vs220±13 mmHg n=6 ,p0.001)。⑶基因转染后1月,HK组大鼠血清肌酐水平与Op only组和GFP组相比无明显变化。2月时,GFP和Op only组大鼠血清肌酐水平继续增加; HK组大鼠血清肌酐水平未进一步升高,但与Op only组相比无统计学差异。3月后, GFP和Op only组的大鼠血清肌酐水平一样持续增加;HK组大鼠血清肌酐水平与2月时相比仍无明显变化,但明显低于Op only和GFP组(58.9±12.3 umol/L vs 133.3±13.5 umol/L vs 127.8±20.33 vs umol/L , n=6 , p0.001)。⑷基因转染后3月,HK组大鼠的24h尿微量白蛋白较GFP和Op only组明显降低(6.95±0.83 mg/24h vs 13.35±1.12mg/24h vs 12.85±1.54 mg/24h ,n=5 ,P0.05);尿渗透压较GFP和Op only组明显升高(589.3±74.1 Osmd/Kg vs 433.3±81.1 Osmd/Kg vs 413.5±68.2 Osmd/Kg ,n=5 ,P0.05)。⑸肾脏病理分析结果显示,GFP和Op only组大鼠的肾组织肾小球显著代偿肥大,系膜增生,球囊明显增厚,系膜区PAS阳性物质不同程度沉着,肾小球周围的肾小管腔也显著扩张,还可见肾小球节段性硬化,部分肾小球坏死。但HK组大鼠的肾组织仅见着色加深,肾小球已无明显代偿性肥大,肾小球周围的肾小管腔也无明显扩张。HK组大鼠的肾小球硬化指数及肾小球面积、PAS阳性面积和细胞数与Op only和GFP组相比均明显减少(P0.05)。⑹实时RT-PCR结果显示:B2R、D1R mRNA的表达水平在HK组明显高于Op only(P0.05);而GFP组和Op only组相比无明显的变化。AT1R、V2R、ETAR mRNA的表达水平则正相反,在HK组明显低于Op only组(P0.05);GFP组和Op only组相比也无明显的变化。说明HK基因转染后能够使慢性肾功能不全的大鼠肾组织B2R、D1RmRNA的表达水平明显上调,尤其是B2R水平;而使慢性肾功能不全的大鼠肾组织AT1R、V2R、ETAR mRNA的表达水平则下调。⑺Western Blot结果显示,在HK组B2受体蛋白的表达水平也明显高于Op only组(P0.05);GFP组与Op only组相比无明显的变化。说明HK基因转染后也能够使慢性肾功能不全的大鼠肾组织B2R蛋白的表达水平明显上调。更进一步在蛋白水平证实HK基因能够明显上调慢性肾功能不全的大鼠肾组织B2R的表达水平。 二、细胞实验:用BK、B2受体拮抗剂(HOE-140)及MAPK抑制剂(apigenin)、PI3K抑制剂(LY294002)和PKC抑制剂(H7)干预培养的人胚肾上皮细胞(293细胞),采用实时RT-PCR技术检测293细胞B2受体mRNA的表达水平;并进一步用Western Blot方法检测BK和HOE-140对细胞信号转导分子MAPK的磷酸化水平和PI3K蛋白表达水平的影响。实验结果显示:⑴BK明显上调293细胞B2受体mRNA的表达。⑵Apigenin和LY294002能够明显抑制BK对B2受体mRNA表达的上调,而H7不抑制BK对B2受体mRNA表达的上调。⑶BK刺激293细胞后,细胞MAPK磷酸化水平和PI3K蛋白的表达水平明显上调,HOE能够抑制其上调效应。 结论1、重组腺相关病毒载体介导的人组织型激肽释放酶基因能够在慢性肾功能不全(切除5/6肾脏诱导)的大鼠模型体内稳定持久表达3月之久。2、组织型激肽释放酶基因不仅能够明显降低慢性肾功能不全大鼠的血压,改善肾脏功能,而且明显减轻肾小球的硬化程度,显示出对慢性肾功能不全确切的治疗作用。3、组织型激肽释放酶基因治疗慢性肾功能不全的作用机制可能是它增强慢性肾功能不全的肾组织的激肽释放酶基因的表达,增加肾脏BK的产生,上调肾组织对肾脏功能调节有益的缓激肽B2受体基因和多巴胺D1受体mRNA的表达,下调肾组织对肾脏功能调节不利的血管紧张素ⅡAT1、内皮素ETA和血管加压素V2受体mRNA的表达。从而提升肾脏的抗损伤能力,拮抗肾脏的损伤效应有关。4、体外实验进一步证实,BK能够明显上调293细胞B2受体mRNA的表达。初步结果显示BK上调B2受体mRNA的表达可能与MAPK和PI3K/AKT信号传导途径有关。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R692.5

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 凃玲;邓娟娟;万槐斌;汪道文;;大鼠残肾模型肾脏组织学和缓激肽B_2受体mRNA表达的变化[J];华中科技大学学报(医学版);2006年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 汤四文;外周多巴胺受体研究进展[J];四川生理科学杂志;2002年03期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 杨智源;多巴胺对肾3型钠氢交换体的调控作用[D];吉林大学;2010年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 支楠;肾清灵治疗慢性肾功能不全100例疗效观察[J];北京中医;2000年04期
2 周雄根,陈敏,赵峻;中药治疗慢性肾功能不全者抑郁症疗效观察[J];长春中医学院学报;2000年01期
3 程鸿鸣;慢性肾功能不全12例误诊分析[J];实用乡村医生杂志;2000年01期
4 杨绪绣;中药保留灌肠治疗急慢性肾功能不全43例临床疗效分析[J];华夏医学;2000年03期
5 曾文,张广宇,付淑霞,王彦,李松;血管紧张素转换酶基因多态性与慢性肾功能不全[J];河北医药;2000年01期
6 冯文学,李希科,詹美兰,吴利军;大黄治疗慢性肾功能不全25例的疗效分析[J];河南医药信息;2000年02期
7 陶雅非,马树勋,任东升;木通中毒致慢性肾功能不全的临床观察[J];河南大学学报(医学科学版);2001年04期
8 杨凌,胡敏燕,侯凡凡,余跃明,张明,付春梅;慢性肾功能不全患者血浆同型半胱氨酸水平检测[J];中国临床药学杂志;2001年05期
9 梁艳,朱清,程银祯;慢性肾功能不全患者血脂代谢紊乱临床分析[J];中原医刊;2001年09期
10 姚沛;慢性肾功能不全33例临床分析[J];农垦医学;2001年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈惠彬;史振玉;;低蛋白淀粉饮食治疗慢性肾功能不全疗效观察[A];中国营养学会第六届临床营养学术会议论文摘要汇编[C];1997年
2 刘世培;;中西医结合治疗慢性肾功能不全30例的体会[A];第七届全国中西医结合肾脏病会议论文汇编[C];2003年
3 刘其刚;;中西医结合治疗56例慢性肾功能不全疗效观察[A];第七届全国中西医结合肾脏病会议论文汇编[C];2003年
4 韩维嘉;陈艳秋;沈雅英;李士捷;张俊;肖菲;孙建琴;;住院老年慢性肾功能不全患者的营养状况[A];中国营养学会第九次全国营养学术会议论文摘要汇编[C];2004年
5 徐玉兰;;逆转慢性肾功能不全[A];浙江省肾脏病骨干医师学术研讨会论文汇编[C];2005年
6 王绍霞;;恶性肿瘤患者合并慢性肾功能不全的饮食指导[A];全国第6届糖尿病护理学术交流暨专题讲座会议、全国第6届血液净化护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2008年
7 刘路鹏;钱叶勇;齐宝玉;常京元;范宇;许晓东;;慢性肾功能不全合并无典型症状横纹肌溶解综合征1例及文献复习[A];2012中国器官移植大会论文汇编[C];2012年
8 董飞侠;;提高慢性肾功能不全疗效的思路[A];首届“之江中医药论坛”暨浙江省中医药学会2011年学术年会论文集[C];2011年
9 赵宏波;张振忠;;张振忠教授治疗慢性肾功能不全经验[A];中华中医药学会第二十一届全国中医肾病学术会议论文汇编(上)[C];2008年
10 张汀;;慢性肾功能不全病人饮食疗效观察[A];四川省营养学会成立十周年纪念暨1998年学术会议专题报告及论文摘要汇编[C];1998年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 孙雪松;慢性肾功能不全的“营养药”[N];中国医药报;2006年
2 市第二人民医院肾内科主任 朱承松;慢性肾功能不全的早期发现和治疗[N];镇江日报;2008年
3 王会玲医学博士、副主任医师;慢性肾功能不全者饮食有讲究[N];上海中医药报;2005年
4 ;中西医结合治疗慢性肾功能不全疗效确切[N];中国中医药报;2004年
5 通讯员  黄治才 宁习源 记者  于莘明;慢性肾功能不全治疗策略有望改变[N];科技日报;2006年
6 本报记者 谭允;饮食治疗慢性肾功能不全[N];广东科技报;2008年
7 柳维刚;慢性肾功能不全误诊为慢性胃病浅析[N];农村医药报(汉);2006年
8 ;肾衰宁胶囊延缓慢性肾功能不全[N];中国中医药报;2003年
9 北京大学人民医院主任医师 王少杰;慢性肾衰并非不可控[N];健康报;2009年
10 ;特色治疗让患者生存质量更高[N];本溪日报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 涂玲;重组腺相关病毒介导人激肽释放酶基因治疗慢性肾功能不全及其机制研究[D];华中科技大学;2006年
2 郑艳辉;益肾清利和络泄浊法治疗慢性肾功能不全临床研究[D];南京中医药大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 周敬;自体诱导性多能干细胞移植治疗慢性肾功能不全的研究[D];昆明医学院;2011年
2 张田学忠;芪归升降散治疗慢性肾功能不全的临床观察[D];北京中医药大学;2007年
3 王顺;农村维吾尔族牙周炎与慢性肾功能不全相关性的初步研究[D];新疆医科大学;2009年
4 罗娟;小儿慢性肾功能不全的临床分析[D];重庆医科大学;2010年
5 杨莉;脑卒中合并慢性肾功能不全危险因素调查[D];新疆医科大学;2012年
6 黄婧文;肾康注射液治疗脾肾两虚、瘀浊内阻型老年慢性肾功能不全的临床疗效观察[D];山东中医药大学;2014年
7 于亚萍;慢性肾功能不全阳虚证治疗法则及作用原理的临床研究[D];南京中医药大学;2010年
8 李影;高效液相色谱—荧光法同时测定慢性肾功能不全患者血清中芳香族氨基酸[D];中南大学;2011年
9 陈雪;465例慢性肾功能不全患者中医证候研究[D];北京中医药大学;2011年
10 章子铭;超声评价慢性肾功能不全患者心血管结构及功能改变[D];华中科技大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026