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《华中科技大学》 2006年
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DHPLC法检测草酸钙尿石患者VKDC结构域基因突变

龚小新  
【摘要】: 目的利用变性高效液相色谱法( Denatured high pressure liquid chromatograghy,DHPLC)筛选维生素K依赖性羧化酶(VKDC)结构域基因,从基因水平上研究草酸钙结石患者肾脏VKDC活性较正常人降低的机制,并探讨DHPLC在基因突变检测中的应用。 方法实验组上尿路结石患者44例,为同济医院及省内各医院收治的住院患者,对照组70例,为同期收治的非结石患者,包括肾肿瘤、前列腺增生和非特异性感染等。联合应用聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)和变性高效液相色谱(Denatured high pressure liquid chromatograghy,DHPLC)技术对44例草酸钙结石患者VKDC基因编码区全部外显子序列进行突变筛查,并对可疑样本行DNA测序证实。 1.采集结石患者肾组织和肾肿瘤患者瘤旁肾组织,非结石和非肾肿瘤患者取外周静脉血,标准方法提取标本中的DNA。 2. PCR扩增包含VKDC所有15个外显子及外显子/内含子剪接区的DNA片段。 3.将所得的扩增产物行2%的琼脂糖凝胶电泳,观察是否获得足量所对应的特异性条带。 4.将不同患者的同一外显子扩增产物等比例混合,行DHPLC(变性高效液相色谱)分析。 5.将DHPLC分析中出现可疑突变曲线者送公司测序证实。结果所有标本均有足量的特异性扩增,DHPLC检测提示两组样本可能存在突变,对这两组的组份分别测序未见突变。结果表明草酸钙结石患者肾组织和对照肾组织VKDC的结构域基因均未见突变。 结论草酸钙尿石患者肾组织内VKDC活性下降与其结构域基因突变没有明显相关性。为进一步研究草酸钙结石患者VKDC活性降低的机制确立了理论依据。DHPLC是一种快速、高通量、自动化且较经济的突变检测方法。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R691.4

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