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《华中科技大学》 2007年
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线粒体DNA4834缺失突变在内耳拟老化模型中的作用及其机制研究

胡钰娟  
【摘要】: 实验一大鼠内耳拟老化伴线粒体突变模型的建立 【摘要】目的探讨建立大鼠内耳拟老化伴线粒体突变模型,为进一步揭示老年性聋发病机制及其防治策略奠定基础。方法Wistar大鼠24只,随机分为2组,A组(D-半乳糖组,14只),5%D-半乳糖颈部皮下注射(150mg*kg-1*d-1),共8周,继以生理盐水腹腔注射10天;B组(空白对照组,10只)全程仅给予生理盐水注射。听性脑干反应(auditory brainstem respones , ABR)检测两组大鼠反应阈,比色法检测两组大鼠膜迷路谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)活力。利用巢氏聚合酶链反应技术检测内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的发生情况。结果用药后A组大鼠线粒体DNA 4834bp缺失突变发生率为100 %(28耳/28耳) ,B组无线粒体DNA 4834 bp缺失突变检出。A组GSH-PX活力(59.07±2.32U)明显低于B组(142.10±2.21U),其差异具有显著统计学意义(t检验,双侧检验,P=0.0000.01)。而A组ABR反应阈平均提高5.36±3.08 dB peSPL,B组为6.50±3.37 dB peSPL。经t检验,A组和B组之间差异无显著性意义(t检验,双侧检验,pAD=0.508)。结论D-半乳糖可以诱导大鼠内耳组织拟老化,此模型大鼠内耳组织线粒体DNA4834bp缺失突变率极高,但是ABR反应阈无明显提高。比较,差异无统计学意义(χ=0.296,P 0.05)。提取核DNA成功率,SDS-蛋白酶K法(60.00%)分别与PCR缓冲液法(90.00%)和Chelex-100法(90.83%)比较,差异均有统计学意义(χ1=49.091,χ2=30.767,均P0.001);PCR缓冲液法与Chelex-100法比较,差异无统计学意义(χ=0.048,P 0.05)。PCR缓冲液法不能从毛干中提取核酸,SDS-蛋白酶K法不能从1、2根鼠毛中提取mtDNA,而Chelex-100法可从毛干和单根鼠毛中提取mtDNA和DNA。结论Chelex-100法对从毛发中提取核酸较为合适。 实验三大鼠线粒体DNA4834bp缺失突变在不同组织器官中的差异表现 【摘要】目的探讨在模型大鼠内耳、肾脏、大脑、血、骨骼肌、脾脏、心脏、肝脏、肺和毛发等不同的组织中,线粒体DNA4834bp缺失突变的发生情况及其可能的病理意义。同时探讨毛发代替血标本用于临床检测线粒体缺失突变的可行性。方法Wistar大鼠24只,随机分为2组,A组(D-半乳糖组,14只),5%D-半乳糖颈部皮下注射(150mg*kg-1*d-1),共8周,继以生理盐水腹腔注射10天;B组(空白对照组,10只)仅给予生理盐水注射。利用巢氏聚合酶链反应技术检测各组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的发生情况。结果用药后A组大鼠各器官均可检出CD,其中内耳、颞肌、肝脏CD检出率最高,为100%,肾脏和大脑次之,为92.86%(a),脾脏85.71%(b),心脏、肺脏和毛发组织为71.43%,血液中检出率最低,仅为35.71%。其中除血液CD检出率与内耳CD检出率比较,差异具有显著统计学意义外(p=0.0010.01,双尾检验,Fisher’s精确概率检验),其他组织和内耳组织CD检出率之间的差异无统计学意义(pa=1.000,pb=0.481,pc=0.098,p均0.05,双尾检验,Fisher’s精确概率检验)。而在对照组中,仅肝脏(20%),大脑和肾脏(10%)检出了CD突变,其他组织均未检出CD的存在。结论提示D-半乳糖除了诱导大鼠内耳4834bp缺失突变以外,可以诱导模型多器官CD突变。CD缺失率高低可能与组织的有丝分裂程度和氧化磷酸化活跃程度有关。同时提示毛发CD检出率更能代表内耳CD缺失情况,可以代替血标本用于临床检测线粒体缺失突变。 实验四大鼠内耳拟老化模型对氨基糖甙类抗生素耳毒性的易感性 【摘要】目的研究大鼠内耳拟老化模型对氨基糖甙类抗生素的易感性。方法Wistar大鼠50只,随机分为4组,A组(半乳糖组,14只)5%D-半乳糖颈部皮下注射(150mg.kg-1.d-1),共8周,继以生理盐水腹腔注射10天;B组(半乳糖加卡那霉素组,14只)皮下注射半乳糖同A组,8周后,腹腔注射硫酸卡那霉素(500mg.kg-1.d-1)10天。C组(卡那霉素组,12只)前8周用生理盐水代替半乳糖,后10天卡那霉素注射同B组。D组(空白对照组,10只)仅给予生理盐水注射。听性脑干反应(auditory brainstem respones , ABR)检测各组大鼠反应阈,比色法检测各组大鼠膜迷路谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)活力。利用巢氏聚合酶链反应技术检测内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的发生情况。结果用药后A组大鼠线粒体DNA 4834bp缺失突变发生率为100%(28耳/28耳),B组为92.86%(26耳/28耳),C组和D组均无线粒体DNA 4834 bp缺失突变检出。A组GSH-PX活性为59.07±8.70U,B组63.29±12.40U,C组136.67±9.53U,D组142.10±7.02U。A组和D组之间差异具有显著统计学意义(pAD=0.000);A组和B组,C组和D组之间差异没有显著统计学意义(pAB=0.307,pCD=0.151)。A组ABR反应阈平均提高5.36±3.08 dB peSPL,B组为61.79±11.20 dB peSPL ,C组为34.17±4.69 dB peSPL,D组为6.50±3.37 dB peSPL。经校正t′检验,A组和D组之间差异无显著性意义(pAD=0.398),B组和C组分别与D组之间差异有显著性意义(pBD=0.000,pCD=0.000),B组和C组之间差异也有显著性意义(pBC=0.000)。结论D-半乳糖可以诱导大鼠内耳组织拟老化,此模型大鼠内耳组织mtDNA4834bp缺失突变率极高,同时对氨基糖甙类抗生素耳毒性的易感性增强。 实验五核因子与mtDNA4834bp缺失突变相互作用在大鼠内耳对氨基糖甙类药物耳毒性易感中的作用 【摘要】目的研究氨基糖甙类抗生素耳聋易感模型中的大鼠内耳膜迷路中线粒体相对拷贝数,核基因编码的核呼吸因子-1(NRF-1)、过氧化物酶增值子激活受体-γ亚单位共激活因子(PGC-1)及线粒体DNA编码的细胞色素C氧化酶亚单位III(COXIII)的mRNA水平变化,以及COXIII蛋白水平的变化和mtDNA4834bp缺失突变,探讨核因子与mtDNA4834bp缺失突变相互作用在大鼠内耳对氨基糖甙类药物易感中的作用。方法Wistar大鼠16只,随机分为2组,A组(半乳糖加卡那霉素组,10只)皮下注射半乳糖同A组,8周后,腹腔注射硫酸卡那霉素(500mg.kg-1.d-1)10天。B组(空白对照组,6只)第一阶段用生理盐水代替半乳糖注射,第二阶段用药同A组。听性脑干反应(auditory brainstem respones ,ABR)检测各组大鼠反应阈,聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)检测内耳线粒体拷贝数(copy number,CN),巢氏聚合酶链反应技术(nest PCR)检测内耳组织线粒体DNA 4834 bp缺失突变的发生情况,半定量的逆转录聚合酶链反应技术(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测内耳NRF-1、PGC-1和COXIII的mRNA水平,蛋白免疫印迹法(western-blot)检测内耳COXIII蛋白水平。结果用药后A组大鼠线粒体DNA 4834bp缺失突变发生率为100%,B组无线粒体DNA 4834 bp缺失突变检出。A组ABR反应阈平均提高66.79±7.75 dB peSPL, B组为8.33±6.83 dB peSPL。经校正t′检验,A组和B组之间差异有显著性意义(P0.01)。A组CN为2.75±1.38,B组5.76±1.04,A组和B组之间差异具有显著统计学意义(P0.01);NRF-1和PGC-1的mRNA水平均较对照组下降(0.51±0.10 vs 0.94±0.06,2.93±0.98 vs 7.92±1.53, P0.01)。COXIII的mRNA水平无明显改变(2.83±0.65 vs 3.15±0.53,P0.05),但是蛋白质水平明显下降(P0.01)。结论核因子与线粒体基因相互调节,其协同作用可能与大鼠内耳对氨基糖甙类药物易感有关。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R764

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【参考文献】
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【共引文献】
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