收藏本站
《华中科技大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

运用反义核酸及TF decoy技术针对猪内皮细胞α1,3GT基因启动子B的研究

黄亚冰  
【摘要】: 第一部分Oligofectamine介导转录因子SP1反义及诱骗性寡核苷酸转染猪内皮细胞系条件的优化研究 【目的】研究拟探索确定高效、稳定的转录因子SP1反义及诱骗性寡核苷酸( AS-ODN及decoy ODNs )在oligofectamine介导下转染猪血管内皮细胞系(SV-40-PED)的最佳转染条件和效果,为以转录因子为靶点的基因治疗在抑制异种排斥反应中的应用奠定基础。 【方法】针对猪α1,3GT基因上游调控序列中4个特异启动子中的启动子B,设计并生物合成数条寡核苷酸分子(AS-ODN、decoy ODNs及错配ODNs),运用oligofectamine转染体系转染永生化猪血管内皮细胞系SV-40-PED。分别应用流式细胞仪和显微荧光技术,同时测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)的含量评价各组PEC的摄取情况以及寡核苷酸分子脂质体转染对PEC生长的影响情况。 【结果】SV-40-PED在oligofectamine的介导下可以摄取SP1 AS-ODN及SP1 decoy ODNs。在6孔培养板中,当SP1 decoy ODNs终浓度为250nM、转染26 h时,转染效率最佳,其摄取率为(93.37±0.85%),荧光强度为(200.30±12.22);同时细胞毒性相对较低(乳酸脱氢酶含量为(49.61±17.13)U/L);此时细胞内荧光物质主要聚集于细胞核。而错配组与阴性对照组相比未见明显不同。 【结论】Oligofectamine转染体系是一种高效、低毒的寡核苷酸转染方式。SP1 ODNs终浓度为250 nM、转染26 h时可以为猪内皮细胞系的转染提供良好效果。本研究为以转录因子为靶点的基因治疗在抑制异种排斥反应中的应用奠定了良好基础。 第二部分转录因子SP1反义及诱骗性寡核苷酸对猪内皮细胞α半乳糖苷链表达的影响 【目的】本研究旨在进一步评价SP1 AS-ODN及SP1 decoy ODNs对猪内皮细胞α1,3-GT基因及α-Gal蛋白表达的影响。 【方法】SP1反义(SP1 AS-ODN)及诱骗性寡核苷酸(SP1 decoy ODNs)转染猪血管内皮细胞系,细胞爬片后荧光显微镜下观察α半乳糖糖链(αGal)抗原表位的表达;蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白表达情况;流式细胞学检测转染后猪血管内皮细胞系膜蛋白αGal的表达;RT-PCR法检测SV-40-PED转染前后α1,3半乳糖转移酶(α1,3GT) m RNA。 【结果】荧光显微镜下细胞爬片可见转染组(SP1 decoy ODNs组)细胞膜荧光表达明显减弱,部分部位可见点状荧光缺损。Western blot显示decoy ODNs /PED的αGal的相对吸光度值为(48.2±0.9),仅为空转染组(只含有转染试剂oligofectamine)(91.6±1.7)的52.6% (P 0 .05)。转染组α1,3GT基因异构体的mRNA表达量(异构体1,0.42±0.20;异构体2,0.27±0.12)显著低于空转染组(异构体1,0.72±0.17;异构体2,0.50±0.19 ;p均 0.05) ,但错配组(错义decoy ODNs组)及空转染组相比差异无统计学意义( P 0.05)。 【结论】SP1 decoy ODNs可以靶向性抑制猪内皮细胞系αGal基因的表达,为抑制超急性排斥反应的研究提供了新的思路和策略。 第三部分转染后猪血管内皮细胞系与抗人血清补体细胞毒作用的实验研究 【目的】本研究旨在成功建立对猪血管内皮细胞系SV-40-PED靶向转染的基础上,拟用猪血管内皮细胞系和人血清建立超急性排斥反应(HAR)体外模型,探讨TF decoy技术处理后的猪内皮细胞结合抗体/补体能力的变化以及是否具有抗人血清补体介导的细胞毒作用。 【方法】在抗体/补体与SV-40-PED结合实验中,运用流式细胞仪检测decoy ODNs转染处理SV-40-PED后结合抗体/补体能力的变化,并通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验评价TF decoy技术对人血清细胞毒效应的保护作用。 【结果】流式细胞学检测中,decoy ODNs组与空转染组相比,无论抗体还是补体结合水平均有不同程度的下降,抗体/补体下降程度依次为IgM 68.0%,IgG 56.1%,C3c 55.1%(P 0.05)。20%正常人血清(normal human serum, NHS)及40%NHS对空转染组和错配组SV-40-PED均有不同程度的杀伤能力,而decoy ODNs转染SV-40-PED后即可呈现出对此效应的保护作用,与空转染组相比,20%NHS组和40%NHS组其靶细胞溶解率分别下降15.0%和30.2% (P0.05),表现为补体对SV-40-PED的杀伤率不同程度的下降。空转染组和错配组间杀伤率无明显差异(P0.05),热灭活正常人血清(heat-inactivated NHS, HINHS)作为阴性对照对各组SV-40-PED均表现出背景毒性作用。 【结论】在体外补体介导的细胞毒反应中,decoy ODNs转染猪内皮细胞SV-40-PED可以呈现出其保护作用。 第四部分转染后猪血管内皮细胞系与人外周血单个核细胞之间的作用研究 【目的】建立人外周血单个核细胞和猪血管内皮细胞的共培养研究模型,在体外模拟异种移植物内皮细胞与人血清相互作用的过程,探讨decoy ODNs在人PBMC对猪血管内皮细胞单向混合培养实验中的影响。 【方法】SV-40-PED转染后分别运用氚3-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)法和MTT法检测人外周血单个核细胞和猪血管内皮细胞共培养模型中人PBMC的增殖情况,探讨人外周血单个核细胞与转染前后猪内皮细胞相互作用的变化。 【结果】未加入刺激细胞的人外周血单个核细胞增生微弱,加入经丝裂霉素C处理的异种刺激细胞SV-40-PED后,各组人外周血单个核细胞均分裂增生,并在5~7d左右逐渐达到最大。在共培养第5天,3H-TdR法检测显示decoy ODNs转染组的cpm值的下降程度为空转染组的67.1%,空转染组和错配组的组间比较无明显差异(P 0.05)。decoy ODNs转染处理SV-40-PED后第5天,MTT法显示人PBMC的增殖能力仅为空转染组的39.2% (P 0.05),呈现出对猪血管内皮细胞的保护作用。 【结论】在人外周血单个核细胞和猪血管内皮细胞的共培养研究模型中,decoy ODNs转染处理SV-40-PED可以部分抑制人PBMC的增殖。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R617;R346

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 赵中辛,杜竞辉,姜汉英,夏穗生;异种移植超急性排斥机理的实验研究[J];中华器官移植杂志;1996年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈耿臻,沈文律,李丽萍,夏仁品,文军;ICAM-1在同种大鼠肝移植物中的表达及其意义[J];海南医学;2005年12期
2 雷志敏,丁俊清,程祥惠,张敏;复方珊瑚糊剂的细胞毒性评价[J];湖北医科大学学报;2000年04期
3 王传斌,丁雪梅,徐江平;烟碱对白细胞介素1β诱导的培养牛脑微血管内皮细胞表达E-选择素的增强作用[J];武汉大学学报(医学版);2001年03期
4 文建华,朱明方,孙杰;益智灵对痴呆模型小鼠中枢胆碱能神经功能的影响[J];湖北中医杂志;2002年08期
5 倪兵,隋淑光,顾福康;包囊游仆虫营养细胞和休眠细胞的胞器酶细胞化学[J];华东师范大学学报(自然科学版);2004年04期
6 杨隽,肖荣华,李馨,黄丽波;牛Y染色体DNA探针的研究[J];黑龙江八一农垦大学学报;1999年01期
7 涂泽松;陈志维;李逸群;;丹酚酸B和高氧液对兔肢体缺血再灌注损伤代谢酶的影响[J];河南外科学杂志;2010年04期
8 岳保红,陈宗德,张光磊;细胞因子对HL-60白血病细胞分化作用的研究[J];河南肿瘤学杂志;2000年04期
9 李敏,王身立,陈嘉勤,禹宽平;DNA具酯酶活性的酶动力学初步研究[J];湖南师范大学自然科学学报;1997年02期
10 黄艳红,谢祁阳,蒋德昭,徐有恒;人类K-562细胞系实验条件的稳定性研究[J];湖南医科大学学报;2000年01期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 陈玉春;高依卿;王碧英;;十全大补汤刺激机体骨髓造血功能机理的探讨[A];全国中医药创新与发展研讨会专辑[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 聂克;脾虚大鼠壁细胞胃泌素受体及黄芪的调控作用研究[D];广州中医药大学;2000年
2 田卫卫;补虚化瘀方拮抗化疗后P388白血病小鼠骨髓抑制的作用及机制探讨[D];成都中医药大学;2001年
3 张巧艳;中药蛇床子的植物资源、种内变异和抗骨质疏松研究[D];第二军医大学;2001年
4 王华;钙、VitD缺乏对骨生长和成骨细胞功能的影响及机理研究[D];重庆医科大学;2001年
5 刘元生;白介素12对T淋巴细胞的凋亡诱导作用及对移植物抗宿主病的影响[D];暨南大学;2002年
6 鲁茁壮;Notch信号促进造血干/祖细胞扩增及间充质干细胞向成骨细胞分化的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
7 朱民;微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用[D];华东师范大学;2003年
8 杨光伦;NF-κB信号传导途径在延迟性异种移植排斥反应中的作用[D];重庆医科大学;2003年
9 宋晓平;小鼠胚胎干细胞定向诱导分化成骨细胞研究[D];西北农林科技大学;2003年
10 汪灏;树突状细胞疫苗抗胃癌作用的临床应用研究[D];第三军医大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李永忠;壮骨镇痛胶囊含药和血浆对共育体系中破骨细胞活性及凋亡的影响的实验研究[D];湖南中医药大学;2010年
2 赵清风;用于绿色建材抗菌性改良的银离子的作用机理[D];中南林业科技大学;2011年
3 许欣;湖羊早期妊娠诊断免疫胶体金层析试纸条的初步研制[D];南京农业大学;2010年
4 王栋;高危型人乳头状瘤病毒与肾癌关联性的研究[D];暨南大学;2000年
5 任宇皓;黄芪多糖、淫羊藿多糖及淫羊藿总黄酮对NDV、IBDV活性的影响[D];南京农业大学;2000年
6 陈鹏;白介素12诱导白血病T淋巴细胞凋亡及对FasL通路信号传导影响的研究[D];暨南大学;2001年
7 覃新干;肿瘤坏死因子基因转导的瘤苗对小鼠机体免疫的影响[D];广西医科大学;2001年
8 支雅军;木黄酮、三氧化二砷单独及联合应用对慢性粒细胞白血病细胞增殖的实验与临床研究[D];苏州大学;2001年
9 杨小明;体外培养内皮细胞与血液有形成份粘附动力学研究[D];浙江大学;2001年
10 苏建国;中华绒螯蟹及中国对虾几种生化指标变化的研究[D];西北农林科技大学;2001年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐令;郭海霞;何波;叶华;;炎症刺激因子TNF-α诱导转录因子ESE-1在内皮细胞中的表达[J];中国病理生理杂志;2007年05期
2 金红;邱文冰;彭庚;王东明;李玉光;;睾酮对人脐静脉内皮细胞部分转录因子活性的影响[J];中国应用生理学杂志;2008年03期
3 李黔宁,应大君,戴光明,郑健;硫代磷酸酯寡核苷酸的合成及其对内皮细胞组织因子(Tissue factor,TF)基因表达及TF促凝活性的作用[J];生物医学工程学杂志;2003年01期
4 王远航;李微;;蒲黄提取物抗人脐静脉内皮细胞氧化损伤的研究[J];中华中医药学刊;2010年10期
5 樊振华;邢飞跃;;氯化钴对人eNOS基因启动子转录活性的影响[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2009年04期
6 毛晓春;李贵刚;张虹;;脂质体介导外源基因体外转染兔角膜内皮细胞条件的优化[J];国际眼科杂志;2008年07期
7 杨益民;李黔宁;应大君;龚自力;成戎川;吕敏;刘勇;周竹娟;郑健;;形成三链DNA的寡核苷酸抑制切应力诱导的大鼠内皮细胞组织因子表达[J];药学学报;2006年09期
8 林芳;高萍;刘丽;王锐;张惠中;;E2F陷阱DNA对人肺癌细胞中stathm in mRNA表达的影响及促进肿瘤细胞凋亡的作用[J];现代肿瘤医学;2007年04期
9 崔晓萍,应大君,李黔宁;反基因寡核苷酸抑制内皮细胞组织因子表达的体外研究[J];心血管康复医学杂志;2004年04期
10 林秋雄;单志新;杨敏;余细勇;;Ang-Ⅱ通过AP-1调控内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子的表达[J];中国病理生理杂志;2010年10期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 汉丽萍;陆军;潘丽娜;邵阳光;黄百渠;;转录辅激活子p300增强人ALAS2基因启动子的转录活性[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年
2 白晶;;在HepG2细胞内转录因子HNF4对肝刺激因子基因转录的抑制作用[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年
3 孙京燕;张寒霜;赵俊丽;李伟明;王立安;;DREB转录因子及其在转基因方面的应用[A];中国棉花学会2006年年会暨第七次代表大会论文汇编[C];2006年
4 张寒;郑胡镛;;转录因子Runx1对SFRS1启动子的调节作用[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
5 孟丹;陈思峰;;转录因子Bach1负性调节Wnt/ β -Catenin信号通路[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年
6 祖旭宇;于玲玲;谢振华;刘峰;孙钦升;蒋宇扬;;Sp1在HepG2细胞中通过与启动子GC盒结合促进Pokemon基因的表达[A];第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2009年
7 林秋雄;单志新;杨敏;邓春玉;朱杰宁;麦丽萍;符永恒;邝素娟;林曙光;余细勇;;AngⅡ通过AP-1调控内皮细胞中巨噬细胞移动抑制因子的表达[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年
8 徐让;钱关祥;;转录因子对Survivin基因的转录调控[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年
9 汪世臣;;拟南芥转录因子DREBs靶基因的计算预测[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编(2004-2008)[C];2008年
10 黄百渠;曾庆华;吕延成;孙迎春;;组蛋白和转录因子在hAMRF基因启动子上的相互作用及对转录的影响[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王小龙;科学家提高了多功能干细胞安全性[N];科技日报;2009年
2 朱航宇 王迪编译;2010:全球寡核苷酸市场翻一番[N];医药经济报;2004年
3 白毅;UXT蛋白可增强转录因子NF—κB活性[N];中国医药报;2007年
4 记者 刘侃;寡核苷酸:生命科学领域新突破[N];科技日报;2006年
5 吴一福;西京医院振荡法支架种植内皮细胞获成功[N];中国医药报;2008年
6 ;6-羟基多巴的细胞毒作用与谷氨酸转运的关系[N];中国医药报;2003年
7 ;中药抗血栓机理及对内皮细胞的生物医学研究取得佳绩[N];科技日报;2000年
8 赵军;耳毒性药物对耳蜗螺旋动脉平滑肌和内皮细胞电生理特性的影响项目[N];科技日报;2007年
9 吴一福;PTFE血管材料可携载VEGF基因转染[N];中国医药报;2006年
10 杨茜;美学者发现抗癌药新生物指标[N];中国医药报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 黄亚冰;运用反义核酸及TF decoy技术针对猪内皮细胞α1,3GT基因启动子B的研究[D];华中科技大学;2007年
2 夏怡丰;穿心莲内酯(Andro)抗炎机制的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
3 吴鹏翠;肌细胞增强因子2A对血管内皮细胞功能的影响及其机制探讨[D];中南大学;2010年
4 杨泽然;胰岛素经PI3K-GSK3β信号通路调节内皮细胞内皮素-1基因表达[D];浙江大学;2007年
5 徐雪峰;宫内不同环境诱导肺动脉高压内皮细胞的表观调控机制研究[D];浙江大学;2011年
6 邢邯英;血红素加氧酶-1对糖尿病血管病变的影响及机制初探[D];河北医科大学;2005年
7 李寒;开放MitK_(ATP)通道对缺血再灌注心肌保护作用研究[D];第三军医大学;2005年
8 房凯;高表达Caveolin-1抑制内皮细胞增殖的信号传递机制研究[D];中国医科大学;2005年
9 付嘉;重组人β2糖蛋白1及其第一结构域对抗磷脂抗体综合症患者血清诱导内皮细胞活化的影响及作为耐受原的初步探讨[D];吉林大学;2006年
10 贾素洁;内源性一氧化氮合酶抑制物与内皮细胞通讯功能障碍及(口山)酮的保护作用[D];中南大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 周炎珍;卵巢癌中Dab2、GATA-4、GATA-5基因启动子CpG岛甲基化分析[D];福建医科大学;2007年
2 孙琳琳;拟南芥原生质体制备及葡萄ERFs调控GCC-box的瞬时表达分析[D];辽宁师范大学;2009年
3 高卉;Ghrelin对缺氧/复氧血管内皮细胞的影响[D];四川大学;2004年
4 陈慧玲;羊栖菜多糖对血管内皮细胞增殖及氧化损伤的影响[D];浙江大学;2005年
5 高哲;基于PWMSA算法拟南芥协同基因调控的预测[D];吉林大学;2009年
6 杨红梅;赤霉素相关转录因子NBF的进一步功能分析[D];新疆大学;2005年
7 李宏;天然及氧化修饰高密度脂蛋白对内皮细胞部分分泌功能的影响[D];四川大学;2005年
8 陈博;缺氧诱导因子-1α基因体外转染骨骼肌细胞及对血管内皮细胞增殖的影响[D];天津医科大学;2006年
9 张传庆;T-bet/IFN-γ信号转导在重型再生障碍性贫血发病机制中的作用[D];苏州大学;2008年
10 赵学强;通心络对自发性高血压大鼠心肌重构干预的实验研究[D];山东大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026