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《华中科技大学》 2007年
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环氧合酶2高表达及siRNA沉默其基因对宫颈癌生物学行为的影响

李允光  
【摘要】: 一、未绝经宫颈癌患者肿瘤组织中环氧合酶2的表达及其意义 目的探讨环氧合酶2(COX-2)在宫颈癌组织中的表达与月经周期的关系及其临床意义。方法选取47例未绝经宫颈癌手术病人,病史结合子宫内膜HE染色观察判断患者所处月经周期时段,采用免疫组织化学SABC法检测宫颈癌组织中COX-2及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,计算机图像分析COX-2免疫染色密度值,计数PCNA标记指数(LI)。结果47例宫颈癌病人,增生期患者COX-2表达阳性率较分泌期无显著性差异,但阳性患者表达强于分泌期。宫颈癌组织中COX-2表达水平与PCNA LI值呈显著正相关性。有淋巴结转移、局部肌层浸润者COX-2表达阳性率高于无转移者,宫颈癌组织中COX-2的表达与FIGO临床分期、组织分化程度无显著相关性。结论未绝经宫颈癌患者肿瘤组织中COX-2的表达在增生期较分泌期明显增强,并参与调节肿瘤的生长、转移。 二、雌、孕激素对宫颈癌Hela细胞环氧合酶-2表达的影响 目的研究17-β雌二醇(E2)、甲羟孕酮(MPA)对Hela细胞肿瘤相关基因COX-2表达的影响。方法将培养的Hela细胞分为对照组、无水乙醇组、E2组、E2+MPA组和MPA组,分别用相应药物处理24h, Western blot、RT-PCR方法检测COX-2蛋白及mRNA表达变化,同时采用免疫细胞化学SABC法染色检测COX-2,PCNA在Hela细胞的表达,计算机图像分析PCNA免疫染色平均光密度值。结果正常培养的Hela细胞即有COX-2蛋白表达,E2可显著上调其蛋白及mRNA表达,而MPA、MPA+E2组COX-2的蛋白及mRNA表达水平显著下调。各组PCNA平均光密度值E2组平均光密度较对照组高,差异显著,E2+MPA组和MPA组显著降低。结论Hela细胞中COX-2的表达受女性激素的调控,E2上调其表达,MPA、E2+MPA下调其表达,并可能因此影响Hela细胞的增殖活性。 三、COX-2 siRNA真核表达载体构建及其效应检测 目的构建可在真核细胞表达COX-2 siRNA的真核表达载体,并检测其对Hela细胞COX-2表达的抑制效应,为研究COX-2基因的功能提供前提条件。方法选择COX-2的全长基因序列作为分析序列,采用Ambion公司软件和siRNA设计原则,设计两条特异的siRNA靶序列,体外合成发卡状siRNA序列,以亚克隆法经BamHI和HindIII酶切位点分别克隆入Pgenesil-1载体,即Pgenesil-C1、Pgenesil-C2,插入一段等长随机序列的P-Control作为阴性对照。经PstI和SalI酶切鉴定和测序后,以脂质体法将其转染至人宫颈癌Hela细胞系,转染48h分别用RT-PCR和Western blot方法评价对COX-2表达的抑制效应。结果酶切鉴定和测序结果证实发卡状siRNA序列成功连接到Pgenesil-1载体,转染Pgenesil-C1、Pgenesil-C2后48h,Hela细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达水平显著降低,效率分别达87%、53%。结论成功构建了针对COX-2基因的siRNA真核表达载体,Pgenesil-C1可以有效抑制COX-2基因的表达。 四、RNAi沉默环氧合酶-2基因对宫颈癌Hela细胞细胞周期影响及其机制的实验研究 目的利用RNA干扰(RNAi)抑制宫颈癌Hela细胞COX-2表达研究其对细胞周期的影响及其机制。方法以脂质体法将COX-2小干扰RNA(siRNA)真核表达载体质粒Pgenesil-C1转染至Hela细胞系,对照质粒P-Control作为对照组。分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性,流式细胞技术检测Hela细胞细胞周期改变,用Western blot方法检测cyclinD1及cyclinE蛋白的表达变化。结果转染Pgenesil-C1后细胞增殖活性受到显著抑制,流式细胞仪分析结果显示转染Pgenesil-C1后Hela细胞G0/G1期细胞较对照组显著增多,而S期和G2/M细胞较对照组显著减少,同时cyclinD1及cyclin E蛋白表达显著降低,转染后96h凋亡细胞较对照组增多,凋亡率为3.25%。结论利用RNAi技术抑制COX-2表达可以降低Hela细胞增殖活性,可能通过下调cyclinD1及cyclin E的表达使细胞周期阻滞于G0/G1期。 五、COX-2基因表达下调对宫颈癌Hela细胞顺铂化疗敏感性的影响及其机制研究 目的利用RNA干扰(RNAi)抑制Hela细胞COX-2表达后凋亡相关基因表达的变化,研究COX-2对Hela细胞顺铂(CDDP)化疗敏感性影响及其作用机制。方法构建特异性COX-2小干扰RNA(siRNA)真核表达载体质粒Pgenesil-C1,以脂质体法将其转染至Hela细胞系,随机序列质粒P-Control作为对照组,G418筛选阳性克隆,用不同浓度CDDP作用于各组Hela细胞12h,用MTT检测Hela细胞的存活率,流式细胞技术检测Hela细胞凋亡率的变化。用RT-PCR方法检测Survivin、Bax和Bcl-2 mRNA的表达变化。结果MTT结果显示Hela细胞存活率随CDDP浓度升高而降低,Pgenesil-C1组较对照组降低更为显著,流式细胞仪分析显示转染Pgenesil-C1组凋亡Hela细胞较对照组显著增多。转染Pgenesil-C1后Survivin和Bcl-2 mRNA表达较对照组和P-Control组显著降低,而Bax mRNA表达无明显改变。结论Hela细胞COX-2基因的表达被抑制后Hela细胞对CDDP的化疗敏感性显著增强,这可能与Survivin和Bcl-2表达下调有关,而与Bax表达无关。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R737.33

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