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《华中科技大学》 2007年
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人前列腺癌骨转移相关基因的筛选及其分子阻遏

廖晖  
【摘要】: 目的:建立人前列腺癌裸鼠骨转移动物模型,筛选高、低不同骨转移潜能的细胞亚株,分析其生物学特性和肿瘤转移相关基因的差异表达,并从中筛选与前列腺癌骨转移相关的候选基因;比较hCXCR4基因在高、低不同骨转移潜能细胞亚株中的表达水平,并构建hCXCR4基因反义真核表达载体,观察转染后对高骨转移潜能细胞亚株的侵袭和转移能力的影响。 方法:采用左心室注射法建立人前列腺癌细胞系PC-3细胞裸鼠骨转移动物模型,分别获取骨和淋巴结转移灶内的肿瘤细胞,经反复体外培养及造模,筛选高、低骨转移潜能的细胞亚株;通过体外黏附率、侵袭能力、细胞增殖率、软琼脂克隆形成率、裸鼠皮下成瘤率等实验分析其生物特性;应用基因芯片技术分析其肿瘤转移相关基因的差异表达,并通过RT-PCR和Western blot检测验证基因芯片检测结果,筛选前列腺癌骨转移相关的候选基因;应用RT-PCR技术从人前列腺癌细胞系PC-3细胞总RNA中扩增包含hCXCR4基因起始编码区的cDNA序列,按反方向加入BamHⅠ及EcoRⅠ双酶切位点后插入含BamHⅠ及EcoRⅠ双酶切位点的pIRES2-EGFP真核表达质粒的多克隆位点上,构建表达反义hCXCR4基因的重组真核表达载体pAhCXCR4/IRES2-EGFP,并与空载体分别转染高骨转移潜能细胞亚株,通过RT-PCR和Western blot检测转染后CXCR4的mRNA和蛋白的表达水平改变,以及观察其体内外侵袭和趋化及骨转移能力的变化。 结果:筛选出具有高、低骨转移潜能的细胞亚株T3B和P24,其裸鼠体内骨转移率分别为8/10(80%)、1/10(10%),与母系PC-3细胞6/15(40%)比较有显著性差异(P0.05);细胞生物学特性分析显示T3B、P24和PC-3的体外黏附率分别为111.68±8.34%、80.26±2.76%和76.87±4.27%,侵袭能力分别为53.1±6.0个/视野、31.2±3.6个/视野和24.4±5.1个/视野,T3B的细胞黏附和侵袭能力均显著高于P24和PC-3(P0.01),三者体外细胞增殖率、软琼脂克隆形成率、裸鼠皮下成瘤率及瘤体大小的差别无显著性意义(P0.05);肿瘤转移相关基因芯片分析结果显示,T3B与PC-3间存在差异表达的基因共24条,其中上调16条,下调8条。P24与PC-3间存在差异表达的基因共24条,其中上调20条,下调4条。T3B和P24较PC-3均上调的基因9条,下调的有2条,而T3B较P24上调的基因有9条,下调的有13条;通过RT-PCR和Western blot检测证实T3B细胞中CXCR4和MMP3在转录和翻译水平上均呈高表达,与P24及其母系细胞株PC-3有显著性差异(P0.01)。重组质粒经BamHⅠ及EcoRⅠ双酶切鉴定后电泳可见5.3 + 0.56kb两条带,与理论计算值完全一致,重组质粒测序结果显示,插入的hCXCR4基因的cDNA序列与基因文库完全一致而方向相反;反义真核表达载体成功转染T3B细胞并稳定表达,与空载体转染组及空白组比较,T3B细胞转染反义表达载体后,其CXCR4 mRNA和蛋白质的表达水平均显著下调(P0.05);体外侵袭和趋化能力明显降低(P0.01),体内骨转移率下降。 结论:运用裸鼠肿瘤转移模型反复筛选,可获得高、低骨转移潜能的人前列腺癌细胞亚株,应用微矩阵基因芯片技术筛选人前列腺癌骨转移相关基因具有快速、灵敏、高通量等特点,为靶向阻遏前列腺癌骨转移提供了候选基因;其中CXCR4基因可能成为抑制前列腺癌骨转移靶向治疗的新位点。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R737.25

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