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三链形成寡核苷酸对大鼠Sertoli细胞尿激酶型纤溶酶原激活因子的反基因研究

田永红  
【摘要】: 第一章大鼠uPA基因特异三链寡核苷酸的设计 第一节大鼠uPA基因生物信息学分析及启动子预测 大鼠尿激酶型纤溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator,uPA)与男(雄)性生殖调控具有密切关系(Liu, 2007;明钰熊承良, 2006;王晓燕熊承良, 2003),而大鼠是常用的生育调节的动物模型,所以对大鼠uPA基因和蛋白的研究颇有意义。大鼠uPA cDNA与其它物种的uPA cDNA相似,与小鼠、人类、狒狒和猪分别有86、76、76和70%的相同序列。在编码区的相似性最高,分别为91、88、83和76%,但在非编码区有很大的差异。大鼠uPA cDNA有编码432个氨基酸的一个大的开放阅读框,该蛋白的预测分子量为48KDa。与上述物种的uPA的氨基酸一致率为88、71、70和69%。如果忽略保守的氨基酸替代物,其一致性将更高,分别为98、93、93和84%。与人类和猪的uPA蛋白不同,大鼠uPA没有潜在的糖基化位点,但却保留着生长因子、kringle、以及所有物种uPA拥有的丝氨酸蛋白酶活性区域。由于反基因技术的应用需要一段尽可能不间断的多聚嘌呤/嘧啶靶序列做为干扰靶位点,而且这种序列多存在于基因启动子范围内,并与转录因子结合部位重叠并与基因表达的调控有关。但是对大鼠uPA基因目前尚缺乏系统的研究报道,我们对大鼠uPA基因进行预测分析表明:在转录起始位点上游27 bp处有一个非经典的TATA盒,但该区域具有典型的GC盒和启动子区所常见的SP1和AP-1等结合区域,表明此区域为真核转录的核心启动子所在区域。另外,在其核心启动子区域内,存在一个位于转录启始位点的上游81 bp和一不典型的结合转录因子并启动转录的TATA盒子上游47 bp处含有25个碱基的嘌呤富集序列,此序列符合反基因技术的靶序列的要求。 第二节三链形成寡核苷酸亲和性测定 在本节中,我们以一个含有多聚嘌呤/嘧啶的大鼠双链uPA基因序列做为靶序列,采用[γ-32P]ATP末端标记的嘧啶链和稍微过量的充足的嘌呤链与所设计的三链形成寡核苷酸进行电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assays, EMSA)分析以测定其亲和力(Kd)。结果表明,在实验条件下,uPA特异性的uPA-PO和uPA-PS都形成了三链结构,然而后者的亲和性较前者差;uPA-PO和uPA-PS的Kd分别为10-7 M和10-6 M。 第二章大鼠支持细胞的原代培养与鉴定 原代支持细胞培养是研究精子发生的有力手段,是研究精子发生以及此过程中支持-支持细胞和支持-生精细胞间相互作用的基础。在本试验中,在前人工作的基础上,采用复合酶消化、低渗处理的方法进行了支持细胞的体外原代培养,并运用多种方法对支持细胞进行鉴定。我们建立了稳定的支持细胞原代培养体系,可达到95%的纯度,可以很好地应用于后续的实验研究。 第三章TFOs对大鼠支持细胞uPA基因的降调节 第一节大鼠uPA实时定量RT-PCR引物设计和方法建立 为设计大鼠尿激酶SYBR Green I实时定量逆转录多聚酶链反应的引物,优化反应条件,建立检测方法。我们通过基因库获取靶基因序列,收集分析相关生物信息数据,应用Oligo 6.22设计引物,并进行实验验证:提取体外培养大鼠睾丸总RNA反转录后运用进行扩增;将扩增产物回收纯化后,10倍倍比稀释后做标准曲线;根据标准曲线的斜率、相关系数和熔解曲线分析进行条件优化并进行可重复性检测。设计的引物长度为21bp;GC含量52.4%;上下游引物3'最稳定二聚第二节三链形成寡核苷酸亲和性测定体和及发夹结构的能量分别为-1.5、-0.40 kcal/mol和-3.5、-0.90 kcal/mol,引物间最稳定二聚体为-3.1 kcal/mol。引物间Tm值和引物与产物Tm差值分别0.3℃和4.9℃;引发效率分别455和403。优化后的25μl反应体系中各组分终浓度为:dNTP 200μmol,Taq DNA聚合酶0.05U/μl,引物200nmol,Mgcl2 3mmol,SYBR Green I 0.2×,cDNA 2μl(20ng)。反应条件为:95℃5min预变性;95℃30s变性,58℃20s退火,72℃25s延伸,82℃5s采集荧光,38个循环,该体系具有101.0~108.7%(斜率-3.299~-3.13)的扩增效率,线形相关系数范围0.996~0.999。可重复性检测中,三种不同浓度样本的批内变异和批间变异分别为0.05%,0.02%,1.7%和1.78%,2.29%,3.54%。该引物能够特异地实现对靶序列的检测,优化建立的SYBR Green I实时定量RT-PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、线性检测范围广的特点,适于对大鼠尿激酶基因表达水平的检测。 第二节TFOs对内源性uPA基因表达的降调节 在睾丸,尿激酶型纤溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator,uPA)由支持细胞产生,它与血睾屏障(blood-testis-barrier,BTB)密切相关,被认为是潜在的避孕靶点。本研究中,应用三链形成寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides,TFOs)对体外培养大鼠支持细胞中的uPA的表达调节来进行研究。支持细胞在330nM的TFOs作用下,uPA在mRNA和蛋白活性都有显著性地下降。而做为纤溶酶原激活因子的另一形式的tPA在一定程度的升高,弥补了总的PAs活性。硫化的TFO对核酸酶的耐受性得到提高,即对TFOs磷酸骨架的硫化提高了其对核酸酶的耐受性。我们的研究证明,TFOs做为有效的分子工具,可以下调uPA的表达。


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