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《华中科技大学》 2007年
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硒诱导产生ROS在MAPKs信号转导通路中的调节作用

邹云锋  
【摘要】: 硒是一种具有重要生物功能的必需微量元素,在生命活动中发挥着重要作用。硒在环境中的分布存在有明显的地域差异,一般热带以及亚热带含硒较高,而温带以及森林或草原地带含硒较低。国外有研究表明,一些肿瘤如胃癌、食道癌、直肠癌等的发病率和硒的地理分布呈负相关,低硒地区肿瘤的发病率和死亡率比较高。国内也有研究通过分析不同肝癌高发区的粮食硒的水平后,发现硒的分布有明显的地区差异,并且与肝癌的流行负相关。一些流行病学调查和动物实验也表明高浓度的硒具有化学防癌作用。 硒的抗肿瘤作用的机制有不少报道,但是总的来说,其防癌、抗癌作用机理目前还不是十分清楚。认为可能主要有以下几个方面:1.抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。各种形式的硒均可以抑制CDC2+和PKC(蛋白激酶C)的活性,从而抑制细胞增殖;硒可以和还原性谷胱甘肽(GSH)反应产生活性氧(ROS),启动一些凋亡信号途径而促使肿瘤细胞凋亡。2.降低一些诱癌因子的诱变性。硒可以降低某些能激活致癌原的羟化酶如芳基羟化酶的活性;硒还可以和一些致癌性的金属离子相互作用,从而拮抗它们的活性。3.调节机体免疫系统,增强人体免疫系统的抗癌能力。4.调节一些生物体内抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化酶的活性,防止脂质过氧化,保护生物膜不受损伤,防止突变。 另一方面,硒的生理需要量范围比较窄,有人认为硒的摄入量超过生理需要量10倍就可能达到中毒阈剂量水平,30~50倍可导致中毒。目前有关硒化合物的毒性作用机制也不是十分清楚,主要认为可能有以下两个方面:1.硒化合物的毒性和其催化产生的ROS有关。硒在较高浓度下产生ROS,它们可以和一些生物大分子包括蛋白质、DNA、脂质发生反应,从而使其受损。2.硒可使体内的一些代谢酶如琥珀酸脱氢酶等失活,从而使机体受损。 总而言之,无论是硒的抗肿瘤作用还是硒的毒性作用可能都和ROS有关。ROS和一些信号转导途径也密切相关,无论是内源性还是外源性的ROS都可以调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的活性。不同的信号途径通过MAPKs调节细胞生理过程的很多方面,包括细胞增殖、分化和凋亡。 本研究用硒处理HepG2细胞以及给Wistar大鼠灌胃后,利用彗星实验、流式细胞术、Western-blot等方法观察细胞的DNA损伤和凋亡情况以及ROS和MAPK的表达水平,探讨硒染毒产生ROS在MAPKs信号转导通路中的调节作用。本研究共分两部分。 第一部分硒诱导HepG2细胞凋亡的作用机制的研究 首先为了了解不同浓度硒对细胞活性的影响,本研究应用MTT试验检测了不同剂量(0、2.5、5、10、20μmol/L)处理HepG2 (12、24、48 h)不同时间后的细胞活性。结果表明随着浓度以及作用时间的增加,亚硒酸钠对HepG2的抑制增殖作用越明显。10μmol/L亚硒酸钠作用12 h和5μmol/L亚硒酸钠作用24 h后细胞活性与对照组比较明显降低,差异有显著性(P0.05)。10、20μmol/L的亚硒酸钠处理细胞后,在三个观察时间点(12、24、48 h)都可见细胞活性明显降低。 为了了解硒处理细胞后ROS的变化情况,本研究用流式细胞仪测定不同浓度硒(0、2.5、5、10、20μmol/L)处理细胞不同时间(0.5、1、2 h)后细胞内ROS的水平。ROS的测定是采用DCFH-DA,它本身不发荧光,进入细胞内后水解生成非荧光的DCFH,在ROS的存在下氧化成发荧光的DCF。结果显示5、10、20μmol/L亚硒酸钠作用于HepG2 lh,随着浓度增加,产生的ROS也增加。与对照组相比,当亚硒酸钠浓度≥5μmol/L时,流式峰明显右移,平均荧光强度增加(P0.05)。10μmol/L亚硒酸钠处理HepG2细胞0.5 h后,即可以见到到荧光强度明显增加(P0.05)。 为了阐明不同浓度硒处理细胞后其DNA损伤以及凋亡情况,我们通过彗星试验(单细胞琼脂糖凝胶电泳)、流式细胞术来检测细胞损伤以及凋亡情况。结果发现0、2.5、5、10、20μmol/L亚硒酸钠作用HepG2 24小时后,当亚硒酸钠浓度≥5μmol/L时,Olive尾矩明显增加,DNA损伤加重,与对照组相比有统计学意义(P0.05)。流式细胞术检测结果表明0、2.5、5、10、20μmol/L亚硒酸钠处理HepG2 24 h后, 5、10、20μmol/L组早期凋亡细胞以及晚期凋亡细胞/坏死细胞均比对照组高((P0.05)。随亚硒酸钠剂量从0μmol/L增加到20μmol/L,早期凋亡率和晚期凋亡/坏死细胞率分别从1.11%、2.60%增加到16.6%、10.15%。10μmol/L亚硒酸钠处理HepG2 0、12、24、48 h后,早期凋亡和晚期凋亡/坏死细胞分别从1.11%、2.60%增加到23.52%、14.8%。 为了了解MAPKs在亚硒酸钠导致细胞凋亡中的可能作用,我们用不同浓度(0、2.5、5、10、20μmol/L)亚硒酸钠处理HepG2细胞4 h后,使用Western-blot技术检测c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)以及p38的表达水平。结果表明各处理组p38、磷酸化p38、ERK1/2和磷酸化ERK1/2水平和对照组无明显差异,而磷酸化JNK1/2的水平随着亚硒酸钠的剂量的增加而增加。10μmol/L亚硒酸钠处理HepG2细胞0、1、2、4、8 h后,用Western-blot技术检测磷酸化的JNK1/2水平。结果1 h后磷酸化的JNK1和JNK2分别为对照的1.58和1.80倍;4 h后磷酸化的JNK1和JNK2分别为对照的2.48和5.03倍;8 h后,和亚硒酸钠处理4 h相比,磷酸化的JNK1/2水平下降。 最后为了进一步阐明ROS以及JNK1/2在细胞凋亡中的可能作用以及ROS对JNK1/2的影响,我们使用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)后来看亚硒酸钠处理细胞对细胞活性、DNA损伤程度、凋亡情况以及JNK1/2表达水平的影响,以及使用JNK1/2抑制剂sp600125后来看凋亡情况以及JNK1/2表达水平的变化。结果表明NAC增加了细胞活性并降低了细胞凋亡率以及DNA损伤程度,并且NAC处理的亚硒酸钠组ROS水平下降,Western-blot结果表明NAC抑制了JNK1的磷酸化。和10μmol/L亚硒酸钠单独作用组比较,Sp600125预处理的10μmol/L亚硒酸钠组磷酸化的JNI1/2水平降低(P0.05),并且与对照组比较,细胞早期凋亡率也下降(P0.05)。 第二部分硒亚急性染毒对wistar大鼠的影响 为了阐明硒的毒作用表现及氧化应激在其中所起的作用,我们将36只雄性wistar大鼠随机分成6组,各组剂量分别为0、0.125、0.25、0.5、1、2mg/kg体重,经口灌胃7周,每天同一时间灌胃一次.每周记录一次大鼠体重以及饲料消耗量,染毒结束后断头取血检测临床生化指标,取肝、肾等组织称重、做病理切变并用彗星实验分析其DNA损伤情况. 结果表明,染毒七周后,和对照组相比,0.125mg/kg组大鼠的平均体重增加,但是经检验无统计学意义; 2mg/kg亚硒酸钠组,7周后体重降低(P0.05)。脏器系数分析结果表明,与对照组相比,1mg/kg和2mg/k亚硒酸钠组,肝脏的相对重量增加(P0.05);2mg/kg亚硒酸钠组,肾脏和脾脏的相对重量增加(P0.01)。对心脏和睾丸则未见影响,各组之间未见差异(P0.05)。 为了检测不同亚硒酸钠浓度对肝肾功能的影响,对肝肾组织做了病理切片并检测了一些临床生化指标。病理切片分析结果显示2mg/kg组肝细胞水肿、变性,组织呈大片空泡样细胞,其它各组未见明显变化;肾组织可见充血、水肿,其它与对照组比较无明显差异。生化分析结果表明随亚硒酸钠剂量增加,丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)均增加,与对照组相比,1mg/kg和2mg/kg亚硒酸钠组,谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)均增加明显(P0.05)。而各组之间血清尿素和肌酐未见明显差异(P0.05)。 为了进一步了解亚硒酸钠染毒产生ROS所造成的氧化应激,我们检测了血清和肝组织的还原性谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量.结果显示血清和肝组织各组间SOD活性无明显差异(P0.05);血清和肝组织的丙二醛(MDA)含量除了2mg/kg亚硒酸钠组与对照组相比明显升高(P0.05),其余各组和对照组之间无明显差异(P0.05);血清GSH在0.5、1、2mg/kg亚硒酸钠组和对照组相比明显降低(P0.05),且有随剂量增加而降低的趋势,肝组织GSH在1、2mg/kg亚硒酸钠组和对照组相比明显降低(P0.05)。 我们通过彗星实验进一步研究亚硒酸钠对大鼠肝、肾的DNA损伤情况。实验结果显示和对照组相比较,0.5、1、2mg/kg亚硒酸钠组肝、肾细胞OTM值增加,表明DNA损伤增加(P0.05)。 综上所述,本研究结果表明: (1)亚硒酸钠可抑制HepG2细胞活性,且具有剂量和时间依赖性,NAC可以拮抗亚硒酸钠对细胞活性的抑制作用。 (2)亚硒酸钠可使HepG2细胞内的ROS增加,而NAC可以使亚硒酸钠诱导的ROS下降. (3)亚硒酸钠可导致HepG2细胞DNA受损,细胞凋亡增加,NAC可以使亚硒酸钠导致的细胞DNA受损程度降低,并减少细胞凋亡。 (4)亚硒酸钠可激活JNK1/2,NAC和sp600125可使JNK1/2磷酸化激活受到抑制,并且sp600125降低了亚硒酸钠导致的细胞凋亡。 (5) 2 mg亚硒酸钠/kg体重亚急性染毒主要导致大鼠肝、肾受损,尤其是肝脏,血清和肝组织的GSH降低,MDA增加,机体的氧化平衡受到破坏可能在亚硒酸钠的毒性中发挥了重要作用。 (6)彗星实验表明DNA损伤可能是亚硒酸钠导致损害比较敏感的指标,可以考虑作为一个亚硒酸钠导致机体损伤的早期评价指标。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R96

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【引证文献】
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【同被引文献】
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8 张公文;银杏叶提取物对大鼠心脏移植心肌细胞凋亡影响的实验研究[D];山东大学;2004年
9 刘宗超;实验性脑出血中NF-κB的作用机制及巴曲酶保护作用的研究[D];吉林大学;2005年
10 张秀花;针刺对MCAO大鼠缺血半暗带影响的基础研究[D];黑龙江中医药大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王凤婕;海洛因依赖人群遗传毒性研究及其机制探讨[D];武汉大学;2005年
2 贾依娜;绞股蓝提取物对衰老机体抗氧化功能及DNA损伤影响的实验研究[D];青岛大学;2006年
3 屈顺林;NOX4在人血管细胞中的表达及其在内皮细胞凋亡中的作用[D];南华大学;2005年
4 李承罡;核因子κB在2-甲氧雌二醇诱导骨尤文氏肉瘤细胞凋亡中的作用研究[D];山西医科大学;2005年
5 唐湘宇;番茄红素对兔动脉粥样硬化形成和内皮细胞氧化损伤的影响[D];南华大学;2006年
6 张海霞;CdTe量子点对人正常肝细胞HL-7702的细胞毒性[D];吉林大学;2009年
7 俞宏;低温诱导淡水白鲳尾鳍细胞CBT凋亡的研究[D];浙江大学;2006年
8 罗琦;新型胂化物药敏性试验研究[D];重庆大学;2003年
9 马懿;亚硒酸钠联合高压氧对颅脑损伤模型鼠细胞凋亡与病理形态的影响[D];遵义医学院;2010年
10 李慧敏;辛硫磷对大鼠肝脏毒性的研究[D];扬州大学;2007年
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