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二十碳五烯酸高产菌株的筛选及发酵条件优化

卢美欢  
【摘要】: 二十碳五烯酸(简称EPA),即5、8、11、l4、17-全顺-二十碳五烯酸,属于ω-3系列不饱和脂肪酸,是人体重要不饱和脂肪酸,具有重要的生理活性功能,有抗凝血、防心血管病、降血脂、防动脉硬化、抗癌、抗炎等作用。二十碳五烯酸的开发应用已受到世界各国科学家的关注与重视。利用微生物发酵生产二十碳五烯酸由于具有周期短,不受环境、季节、气候影响等优点,是近年来国内外的研究热点。 本论文首先建立了从土壤中快速筛选二十碳五烯酸高产菌株的方法。利用植物组织诱生法从土壤中富集菌株,并用苏丹染料染色法对菌丝染色,选择脂肪含量高的菌株作复筛。两种方法结合后快速有效地从土壤中筛选到了二十碳五烯酸高产菌株D283。该菌株的原始二十碳五烯酸含量为6.51%,二十碳五烯酸产量为80.01 mg/L。通过菌丝形态,脂肪酸成分分析和18S rDNA序列分析鉴定为腐霉。 对腐霉D283发酵生产二十碳五烯酸的菌丝形态进行了研究,发现接种量在3-10%、培养温度25-30℃、添加大豆油能解决腐霉D283菌丝成团问题,使菌丝利于接种、生长及EPA积累。 对腐霉D283发酵生产二十碳五烯酸的基本培养基进行了优化,发现产二十碳五烯酸最佳碳、氮、磷源分别为浓度为100 g/L的大米粉水解液、5 g/L的酵母粉、3 g/L硝酸钠及1 g/L的磷酸氢二钠。最适培养条件是pH值4.0、接种量8%、28-20℃变温二步培养(即28℃培养2天转20℃培养3天)。培养过程中,最高EPA产量674.55 mg/L在初糖浓度120 g/L,培养8 d时获得。 在此基础上,进行了主要营养成分消耗、腐霉D283菌体生长、油脂合成和合成二十碳五烯酸的动力学分析,发现低初糖浓度有利于缩短菌体生长的延滞期,初始氮浓度对菌体生物量影响不大。最高含油率在葡萄糖耗尽后出现。二十碳五烯酸含量呈S型变化,培养初期,二十碳五烯酸含量较高,随着菌体的快速增长,二十碳五烯酸含量反而下降,在残糖含量低于10 g/L后,二十碳五烯酸含量逐渐增加。


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