收藏本站
《华中科技大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建,表达及特异性研究

代维  
【摘要】: 目的构建含抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)和EGFP融合蛋白基因的重组真核表达载体pTfRscfv-EGFP。并转染至COS-7细胞中进行表达,鉴定融合蛋白的生物学活性。为单链抗体-荧光融合蛋白在肿瘤示踪、定位、显像等方面的研究奠定基础。 方法以Chi7579-pγ-Expr和Chi7579-pκ-Expr载体为模板,设计两对引物引入中间连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamHⅠ,采用重叠延伸PCR的方法,分别扩增抗TfR单链抗体的轻、重链可变区(VL、VH)基因,二基因之间以连接肽(Gly4Ser)3的编码序列连接,从而构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因。将获得的单链抗体基因克隆至pGEM-T载体(scFv-T),转化大肠杆菌DH5α,进行蓝白筛选,挑取阳性克隆扩增。提取质粒以HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定,并测序证实正确后,亚克隆至pEGFP-N1,获得pTfRscfv-EGFP,转染COS-7细胞,倒置相差荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,荧光分光光度计检测细胞分泌上清荧光强度,并通过流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清与乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375的结合活性。 结果测序结果表明获得了正确的L-VH-Linker-VL单链抗体基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,HindⅢ和BamHⅠ双酶切可见约800bp的小片段和约4.5Kb的大片段,与理论计算值相符,表明pTfRscfv-EGFP真核表达载体构建成功;表达载体瞬时转染COS-7细胞,24小时后,可见荧光在细胞中呈指环状分布,细胞核无表达,为典型的分泌性表达模式,而pEGFP-N1空载体转染细胞中,荧光则呈弥漫性分布,以核中分布较多。收集转染后72h的细胞培养上清,用F4500荧光分光光度计检测其荧光强度,实验组细胞上清的荧光强度较对照组高出约两倍以上,证实抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在转染细胞中分泌性表达;FCM检测转染细胞培养上清与A375细胞及MCF-7细胞的结合,结果表明抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白能够与上述天然高表达TfR的细胞特异性的结合,对照组细胞培养上清则未见与上述细胞有结合。 结论成功构建抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的真核表达载体pTfRscfv-EGFP,融合蛋白可在COS-7细胞中分泌性表达,且具有与TfR阳性细胞结合的活性并发绿色荧光,本实验为进一步将该融合蛋白作为肿瘤示踪、定位、显像的特异性分子奠定了基础。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R392;R73-3

免费申请
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;奚锦;俞琦;王乾宇;黄高;;抗蛔虫人源单链抗体库的构建及鉴定[J];湖南师范大学自然科学学报;2011年03期
2 周金桥;孙剑瑞;宋来君;刘宇;;组织蛋白酶D酶原和转铁蛋白受体在人脑胶质瘤中的表达[J];中国神经精神疾病杂志;2011年05期
3 徐宏勇;徐立;李开宗;;一种新型胃肠道癌特异性单链抗体的表达及其在胃癌中的检测[J];胃肠病学和肝病学杂志;2011年08期
4 牛坚;张业伟;刘斌;;抗人AFP单链抗体的制备、鉴定及其免疫学活性的测定[J];肝胆胰外科杂志;2011年04期
5 苏雪莹;赵振富;徐杰;汪华侨;初国良;;人源性老年痴呆单链噬菌体抗体库的构建[J];中国老年学杂志;2011年17期
6 林晓思;许健;王生育;颜江华;;抗CD5单链抗体的基因构建、蛋白纯化及活性鉴定[J];中国生化药物杂志;2011年04期
7 陈劲;龚波;沈丽敏;李海川;李俊;;sTfR与孕妇、新生儿、婴儿亚临床缺铁及缺铁性贫血前瞻性纵向研究[J];中国儿童保健杂志;2011年09期
8 谷铁军;张海玉;段冶;韩明明;卫巍;姜春来;吴永革;孔维;;抗狂犬病病毒糖蛋白单链抗体Fv57多克隆抗体的制备[J];中国生物制品学杂志;2011年09期
9 王江涛;王捷;;利用人源化噬菌体抗体库筛选骨唾液酸蛋白的单链抗体[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年09期
10 高国辉;黄奇迪;王金丹;杨纪锋;包兵兵;胡孝渠;;Anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白靶向结合体外乳腺癌细胞表面受体的研究[J];中国细胞生物学学报;2011年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 肖代雯;沈昕;邢薇;黄宇;雷萍;朱慧芬;刁智娟;刘红云;沈关心;;抗TfR双价抗体的构建、表达及其鉴定[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
2 王长军;唐家琪;李先富;潘秀珍;操敏;;抗人红细胞血型抗原噬菌体单链抗体的研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(下册)[C];1999年
3 王洪利;舒建昌;;单链抗体在肝脏疾病中应用的研究进展[A];广东省肝脏病学会2007年年会论文集[C];2007年
4 孙娜娜;王欲晓;周丽君;王刚;;人源性抗大疱性类天疱疮抗原BP180-NC16A单链抗体的构建及表达[A];2009全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2009年
5 张惠中;;细胞内生成的抗整合酶单链抗体阻断HIV-1复制的实验研究[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
6 王欲晓;乔媛媛;周丽君;;人源性抗蓖麻单链抗体的分离纯化和活性鉴定[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
7 汪世华;胡开辉;杨燕凌;邱君志;;基因工程单链抗体研究[A];2005全国第二届核酸疫苗研讨会论文集[C];2005年
8 林志伟;汪世华;王宗华;;抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单链抗体(DON-ScFv)在枯草芽孢杆菌中高效表达与分泌[A];中国生物工程学会2006年学术年会暨全国生物反应器学术研讨会论文摘要集[C];2006年
9 杨燕凌;;酶(蛋白)融合技术研究[A];华东地区农学会学术年会暨福建省科协第七届学术年会农业分会场论文集[C];2007年
10 陈立;宋今丹;;抗人大肠癌重组单链抗体的研制[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 陈勇毅 通讯员 李亚平;中医药治再障明显优于西药铁剂[N];中国中医药报;2005年
2 本报记者 刘艳芳 整理;探求可靠的生化指标[N];中国食品报;2008年
3 北京市医疗器械检验所 康娟 刘毅;临床检测仪器新面孔[N];健康报;2010年
4 本报记者 李建荣;雏鹰展翅向蓝天[N];大众科技报;2011年
5 曹勇;方兴未艾的药物释放领域[N];中国医药报;2002年
6 ;虽是配角,也唱得红红火火[N];医药经济报;2000年
7 姜卯生;四军医大颌骨肿瘤研究获成果[N];中国医药报;2002年
8 本版编辑编译;青蒿素与癌症治疗[N];医药经济报;2002年
9 蔡忠仁;我国海洋生物毒素检测技术获突破[N];中国海洋报;2010年
10 中国医学科学院医药生物技术研究所研究员 邵荣光;高效小型化唱主角[N];健康报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 胡学军;抗乙肝病毒表面抗原PreS1(20-47)单链抗体基因克隆及其在大肠杆菌和烟草中的表达[D];大连理工大学;2002年
2 田媛;前列腺癌细胞结合单链抗体的筛选、表达纯 化及其功能初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
3 李月红;抗ICAM-1单克隆抗体与单链抗体的制备及其生物学特性研究[D];吉林大学;2005年
4 陈德宇;前列腺素D合成酶在男性生殖中的基础及应用研究[D];南京师范大学;2005年
5 熊盛;重组人源抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌和巴氏毕赤酵母中的表达、纯化与性质鉴定[D];华南理工大学;2002年
6 邵长利;抗人红细胞单链抗体融合HIV-1gp41抗原肽双功能分子的制备与鉴定[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
7 万忠海;抗PEA单抗和单链抗体制备及在绿脓感染中的应用[D];吉林大学;2008年
8 杨瑞梅;单链抗体介导狂犬病毒shRNA靶向制剂的研究[D];甘肃农业大学;2010年
9 付建芳;溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗的研究[D];第四军医大学;2005年
10 余自强;抗血小板胶原受体糖蛋白VI单克隆抗体的制备和功能研究[D];苏州大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 肖代雯;抗TfR单链抗体及其双价抗体的构建、表达及鉴定[D];华中科技大学;2006年
2 代维;抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建,表达及特异性研究[D];华中科技大学;2007年
3 徐飞虎;抗肺癌单链抗体偶联绿色荧光蛋白基因的构建及表达研究[D];浙江大学;2003年
4 赵蕾;抗鸡传染性支气管炎病毒单链抗体原核表达质粒的构建及其间接ELISA筛选方法的建立[D];上海交通大学;2011年
5 张薇;抗T-2毒素单链抗体的制备及该毒素对细胞毒性影响的初步研究[D];福建农林大学;2010年
6 王溪桥;大容量人源肝癌核糖体展示单链抗体库的构建[D];兰州大学;2010年
7 江淼;抗活化血小板表面受体全套单链抗体噬菌体展示文库的构建和筛选[D];苏州大学;2003年
8 纪秋野;抗蓖麻毒素单链抗体的构建、表达、纯化及功能测定[D];黑龙江八一农垦大学;2010年
9 张庆丽;抗EGFRvⅢ特异性单链抗体的构建及其靶向性研究[D];南华大学;2011年
10 刘晓雷;抗伏马菌素B_1单链抗体的制备[D];福建农林大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026