收藏本站
《华中科技大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

GGC肽/hSSTr2a融合受体核素报告基因显像的实验研究

沈艳霞  
【摘要】: 目的:将编码GGC肽(diglycylcysteine,双甘氨酰半胱氨酸)的基因序列与人生长抑素2a型受体(hSSTr2a)基因的膜外N端开放阅读框相连接,构建融合受体重组腺病毒载体Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP。通过体外受体结合试验、细胞摄取试验、核素报告基因显像等一系列体外与体内实验研究,探讨以GGC序列为报告基因进行核素报告基因显像的可行性,以期建立一种新型的核素报告基因显像系统。 方法: 1.重组腺病毒载体Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP的构建与表达鉴定。 采用RT-PCR方法扩增hSSTr2a基因全长cDNA序列,将GGC肽的基因序列(亲水序列P1,疏水序列P2)与hSSTr2a的膜外N端开放阅读框相连接,通过一系列基因工程技术构建同源重组腺病毒骨架质粒pAdEasy-1/GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP (pAd-SIG-P1, P2)。提取pAd-SIG-P1和pAd-SIG-P2质粒并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,酶切线性化后经脂质体(Lipofectamine2000)介导转染HEK293细胞,同源重组产生融合受体重组腺病毒载体Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP ( Ad5-P1/STR ,Ad5-P2/STR)。经PCR鉴定后进行大量扩增和纯化,采用PCR、荧光显微术鉴定目的基因的表达,并测定病毒感染滴度。 2. Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP在人乳腺癌MCF-7细胞内的表达。 以MOI = 50的重组腺病毒(Ad5-P1/STR, Ad5-P2/STR)感染人乳腺癌细胞MCF-7后,分别在24h、48h、72h和96h采用荧光显微术与流式细胞术检测细胞内EGFP的表达。研究99mTc-HYNIC-TOCA与受感染MCF-7细胞的体外受体结合特性。并利用99mTc-GH放射性摄取实验研究GGC肽在MCF-7细胞的表达。 3. Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP在荷瘤裸鼠体内的报告基因显像。 建立荷人乳腺癌裸鼠模型(双侧上肢荷瘤),以重组腺病毒Ad5-P1/STR、Ad5-P2/STR、Ad5-EGFP及Ad5-TIS(Ad5-HSV1-TK-IRES-hSSTr2a)对照性注射于两侧瘤体内(1×109IU),于感染48h后分别进行以99mTc-GH和99mTc-HYNIC-TOCA为显像剂的核素报告基因SPECT显像以及GFP活体荧光显像。同时以1×108~3×109 IU梯度滴度的重组腺病毒分组感染两侧瘤体,48小时后进行核素报告基因SPECT显像。通过感兴趣区(region of interest, ROI)技术进行半定量分析,计算肿瘤/非肿瘤比值(T/NT)。显像完毕后进行生物学分布实验,测定离体肿瘤标本的放射性计数,计算显像剂在裸鼠体内各脏器及肿瘤组织的克组织百分摄取率(%ID/g)。分别取感染Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR两侧肿瘤组织固定保存,以免疫组织化学技术检测病毒感染后肿瘤组织内hSSTr2a蛋白的表达。 结果: 1.重组腺病毒载体Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP的构建与表达鉴定。 重组腺病毒载体Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP(Ad5-P1/STR,Ad5-P2/STR)构建正确,PCR可特异性扩增出hSSTr2a片段(1212bp),荧光显微镜下显示出绿色荧光蛋白EGFP (enhanced green fluorescent protein)的表达。测得Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR的TCID50值均为8.2×109/mL。 2. Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP在人乳腺癌MCF-7细胞内的表达。 重组腺病毒以MOI=50感染MCF-7后,细胞内EGFP的表达随时间的延长而逐渐增强,至感染后48h,显微镜下绿色荧光最强且集中,流式细胞术检测其EGFP表达率为99.6%。72h后荧光逐渐减弱,流式细胞术检测EGFP表达率亦逐渐减低。以MOI=50的重组腺病毒感染后,MCF-7细胞对99mTc-GH的摄取率随时间延迟而逐渐增高,30min后重组腺病毒感染组与Ad5-EGFP感染的对照组细胞的摄取率有显著性差异( Ad5-P1/STR vs Ad5-EGFP : t=4.267~39.728 , Ad5-P2/STR vs Ad5-EGFP :t=4.362~9.455 , P均0.01 )。而Ad5-P1/STR组与Ad5-P2/STR组无显著性差异(Ad5-P1/STR vs Ad5-P2/STR:t=0.347~1.083,P0.05)。以MOI=0~100的重组腺病毒感染MCF-7后,细胞对99mTc-GH的摄取率均随感染滴度的增加而逐渐增加,且细胞对99mTc-GH的摄取率与Ad-P1/STR或Ad-P2/STR的感染滴度之间存在良好的相关性,R2分别为0.8997和0.9242 (P均0.01)。 3. Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP在荷瘤裸鼠体内的报告基因显像。 活体GFP荧光显像可见,感染Ad5-P1/STR、Ad5-P2/STR和Ad5-EGFP的肿瘤部位均可见绿色荧光,而感染Ad5-TIS的肿瘤部位未见绿色荧光。体内放射性核素显像可见,感染重组腺病毒Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR的肿瘤部位可被99mTc-GH显像,而感染Ad5-EGFP的肿瘤部位无明显显像剂浓聚,其5h的T/NT比值有显著性差异(tP1, EGFP=4.780, tP2, EGFP=8.981, P均0.05)。感染Ad5-P1, P2/STR的肿瘤部位在99mTc-GH显像与99mTc-HYNIC-TOCA显像中均可见显影,而感染Ad5-TIS的肿瘤部位仅在99mTc-HYNIC-TOCA显像中显影。以不同滴度的重组腺病毒感染肿瘤后显像提示,肿瘤组织对显像剂的摄取随感染滴度的增高而逐渐增加,且平均% ID/g值与Ad5-P1/STR或Ad5-P2/STR感染滴度的对数值呈线性相关(相关系数R2分别为0.8458和0.8948,P均0.05)。而感染Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR的两组肿瘤的平均% ID/g值之间无显著性差异(t=0.039~2.314,P均0.05)。免疫组织化学检测显示,感染Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR的肿瘤组织内均可检测到hSSTr2a的表达。 结论:含有GGC肽和hSSTr2a基因序列的融合受体重组腺病毒载体Ad5-P1/STR和Ad5-P2/STR构建成功。重组腺病毒感染荷瘤裸鼠后,GGC肽在其体内的表达可被核素显像所显示,肿瘤组织对显像剂的摄取与病毒感染滴度具有良好的相关性。GGC序列有望作为新型报告基因用于核素报告基因显像。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R817

知网文化
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 邸丽娟;张旭初;张春丽;王荣福;;RGD肽类肿瘤受体显像剂的研究进展[J];标记免疫分析与临床;2007年01期
2 陈红梅;;生长抑素类似物在非神经内分泌肿瘤领域的研究进展[J];白求恩军医学院学报;2010年05期
3 张春丽;王荣福;张丽;郭凤琴;李玲;康磊;闫平;杨铭;;靶向整合素α_vβ_3受体的新型RGD肽二聚体的~(131)I标记与生物活性的初步评价[J];北京大学学报(医学版);2011年02期
4 刘明学,吴凯南,赵小波;槲皮素联合奥曲肽对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖的影响[J];重庆医学;2005年10期
5 秦浙学;李前伟;刘广元;谢赣丰;罗朝学;黄定德;;~(188)Re标记VEGF多肽片段的荷瘤裸鼠体内分布及显像研究[J];第三军医大学学报;2009年06期
6 赵伟,张秀丽;PET报告基因显像研究进展[J];国外医学(放射医学核医学分册);2005年05期
7 王佳琼;王自正;姚薇萱;王峰;;乳腺肿瘤生长抑素受体表达与生长抑素受体显像[J];国际放射医学核医学杂志;2006年01期
8 王喆,汪静;受体转基因显像研究现状与进展[J];核技术;2004年06期
9 张国鹏;兰晓莉;陈铨;曹卫;何勇;张永学;;报告基因系统HSV1-sr39tk/FIAU监测治疗基因表达的体外研究[J];核技术;2010年08期
10 郭飞虎;刘婷;陈玉清;赵贵植;陈大明;杜进;;正电子核素标记奥曲肽类似物的研究进展[J];核化学与放射化学;2012年02期
中国博士学位论文全文数据库 前9条
1 钟兴;hNIS转染鼻咽癌介导放射性核素显像和治疗的实验研究[D];暨南大学;2010年
2 陈丽波;新型放射性分子探针~(99m)Tc-HYNIC-PEG_4-E“PEG_4-c(RGDfK)”_2在肺癌中的基础研究及临床应用研究[D];吉林大学;2011年
3 孙逊;生长抑素受体显像监测基因治疗的实验研究[D];华中科技大学;2006年
4 靳红;生长抑素受体SSTR2和SSTR5在喉癌中的表达及奥曲肽对喉癌Hep-2细胞增殖的抑制作用[D];吉林大学;2007年
5 房娜;HSV1-tk基因探针~(18)F-FHBG的标记及乳腺癌PET-CT显像的实验研究[D];吉林大学;2007年
6 王喆;hSSTR2基因转染肺癌细胞的肿瘤核素显像与杀伤研究[D];第四军医大学;2008年
7 刘影;HSV1-tk/FIAU报告基因系统心脏SPECT显像的实验研究[D];华中科技大学;2009年
8 龚荣芳;一类反问题—生物体发光断层成像—的理论分析和数值模拟[D];浙江大学;2009年
9 张国鹏;两种核素报告基因系统用于监测治疗基因VEGF165表达的基础研究[D];华中科技大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高玉婷;~(99)Tc~m-DOTA-NOC的制备及其对乳腺癌荷瘤鼠显像与生长抑素受体表达水平的相关性研究[D];南京医科大学;2010年
2 谢江;~(18)F标记的对氟苯乙酮酯类叶酸衍生物的制备[D];复旦大学;2011年
3 赵小波;青蒿琥酯钠对乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231增殖和凋亡影响的实验研究[D];重庆医科大学;2003年
4 刘明学;槲皮素联合奥曲肽对人乳腺癌细胞株MCF-7及MDA-MB-231生长增殖的影响[D];重庆医科大学;2003年
5 张世睿;βG及其前体药自杀基因系统对人肾癌细胞作用的实验研究[D];第四军医大学;2005年
6 张诗峰;联合应用生长激素和生长抑素对乳腺癌移植瘤动物模型治疗作用及影响的实验研究[D];广西医科大学;2006年
7 王佳琼;乳腺癌~(99m)Tc-Octreotide生长抑素受体显像的研究[D];南京医科大学;2006年
8 罗联哲;生长抑素类似物~(99m)Tc-EDDA/HYNIC-Lys~0-TOCA的制备及其糖基化衍生物合成方法研究[D];中国原子能科学研究院;2006年
9 伍军;~(99m)Tc-Octreotide用于hSSTr2报告基因显像的实验研究[D];华中科技大学;2006年
10 肖晨;胃癌组织中生长抑素2型受体与P15、P16的表达及意义[D];广西医科大学;2008年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 廖亚平;张洁;周俊宜;汪华侨;;人端粒酶催化亚单位hTERT基因重组腺病毒载体的构建与鉴定[J];神经解剖学杂志;2006年06期
2 张曦;刘耀;陈幸华;高力;高蕾;彭贤贵;王庆余;;血管细胞贴附分子-1和绿色荧光蛋白双基因共表达重组腺病毒的构建[J];中国实用内科杂志;2007年S1期
3 陈水木;何秀云;王艳军;黄香玉;邓洪平;;结核分枝杆菌抗原的重组腺病毒载体的有效构建编码[J];西南大学学报(自然科学版);2008年01期
4 许波群;李瑛;薛凯;李梅;马翔;刁飞扬;崔毓桂;刘嘉茵;;人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定[J];医学研究生学报;2010年02期
5 余惠珍;谢良地;朱鹏立;许昌声;王华军;李体远;;人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达[J];中国病理生理杂志;2008年02期
6 蔡军,林国生,江洪,王腾,曾彬,罗浩,郭军,李俊,汪蕾;人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定[J];第四军医大学学报;2005年20期
7 司英健;张曦;陈幸华;刘耀;高蕾;高力;张诚;彭贤贵;王庆余;;VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒的构建[J];重庆医学;2007年17期
8 司英健;张曦;陈幸华;刘耀;高蕾;高力;彭贤贵;光丽霞;王庆余;;Cx43和GFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定[J];重庆医学;2007年10期
9 张曦;司英健;陈幸华;刘耀;高力;高蕾;彭贤贵;王庆余;;Ad-vcam-1-gfp重组腺病毒转染人脐血源基质细胞的实验研究[J];中国实验血液学杂志;2008年03期
10 李方成;李军亮;吴中华;张培峰;黄文林;刘然义;;大鼠GLUT3基因重组腺病毒载体的构建及鉴定[J];中华神经医学杂志;2006年11期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 郭浩;彭毅志;辛海明;;小鼠CCR7基因重组腺病毒的构建与鉴定[A];第八届西南五省一市烧伤整形学术会议暨贵州省医学会烧伤整形分会2010年学术年会论文汇编[C];2010年
2 郭浩;彭毅志;辛海明;;小鼠CCR7基因重组腺病毒的构建与鉴定[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年
3 沈艳霞;何勇;雷萍;张国鹏;张永学;;重组腺病毒Ad5-GGC-hSSTr2a-IRES-EGFP在荷瘤裸鼠体内的报告基因显像(摘要)[A];湖北省抗癌协会肿瘤影像专业委员会成立暨第一届学术大会论文汇编[C];2009年
4 司英健;张曦;陈幸华;刘耀;高蕾;高力;彭贤贵;王庆余;;GFP和Cx43双基因重组腺病毒载体的构建[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
5 张曦;刘耀;陈幸华;高蕾;高力;彭贤贵;王庆余;;EGFP和VCAM-1双基因共表达重组腺病毒载体的构建[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
6 郭国宁;;成骨细胞特异性转录因子Cbfa1重组腺病毒的构建、纯化及表达[A];第十一次全国急诊医学学术会议暨中华医学会急诊医学分会成立二十周年庆典论文汇编[C];2006年
7 司英健;张曦;陈幸华;刘耀;高蕾;高力;张诚;彭贤贵;;VCAM-1和EGFP双基因共表达重组腺病毒的构建[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
8 汪琦;朱舟;王伟;;大鼠缝隙连接蛋白Connexin 43的shRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
9 刘栋;李密杰;马伟;李爱民;蓝贤勇;陈宏;;秦川牛NRIP1基因重组腺病毒载体的构建[A];中国畜牧兽医学会养牛学分会2011年学术研讨会论文集[C];2011年
10 樊守艳;梁平;张晓燕;;小鼠FAM3C基因重组腺病毒载体的构建与鉴定[A];中南地区第八届生理学学术大会论文摘要汇编[C];2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 李天舒;人脑基因剪切体被发现[N];健康报;2007年
2 ;新技术在药效物质基础研究中的应用[N];中国医药报;2005年
3 记者 李天舒 通讯员 朱丹萍;可携带报告基因的甲型流感病毒“人造”成功[N];健康报;2011年
4 段文;中科院昆明动物所:发现人类大脑中存在特有基因剪切体[N];中国医药报;2007年
5 申宝忠 衣晓峰 岳金凤;活体荧光成像:看得见肿瘤生长过程[N];健康报;2006年
6 鞠长荣 岳金凤 记者 李丽云;哈医大四院设计出光学分子成像设备[N];科技日报;2006年
7 钟新;细菌充当食品安全评价师[N];中国环境报;2006年
8 记者 朱伟光 特约记者 朱伟华 通讯员 鞠长荣 岳金凤;哈医大四院推出绿色荧光蛋白活体成像系统[N];光明日报;2006年
9 记者  章迪思 实习生 周惠婷;山羊成为人类干细胞“孵化器”[N];解放日报;2006年
10 本期嘉宾 佘建明 张保龙 省农科院遗传所 主持人 罗兵前 邵晓玲;转基因水稻安全引发争议[N];江苏农业科技报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 沈艳霞;GGC肽/hSSTr2a融合受体核素报告基因显像的实验研究[D];华中科技大学;2008年
2 孙永科;表达猪瘟病毒石门株E0/E2基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究[D];西北农林科技大学;2007年
3 陈漉;特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究[D];吉林大学;2009年
4 夏天;重组腺病毒AdCD40Ig联合供体静息B淋巴细胞预处理诱导小鼠皮肤移植耐受的研究[D];四川大学;2004年
5 王立夫;重组腺病毒载体介导的VEGF_(165)基因增强大鼠TRAM皮瓣存活的实验研究[D];四川大学;2004年
6 张园;重组人组织因子腺病毒干扰载体的构建及其转染人血管平滑肌的体外研究[D];南方医科大学;2008年
7 付勇;重组腺病毒(Ad-GFP)感染胚胎大鼠神经干细胞及耳蜗移植的实验研究[D];华中科技大学;2007年
8 董磊;以前列腺干细胞抗原为靶点的重组蛋白及重组腺病毒载体疫苗的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
9 徐莉春;环境内分泌干扰物筛选的受体报告基因试验研究[D];南京医科大学;2005年
10 孙逊;生长抑素受体显像监测基因治疗的实验研究[D];华中科技大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 唐建华;降脂药物筛选模型的建立及其在决明子降脂作用机理研究中的应用[D];四川大学;2005年
2 潘飞燕;基于甾类激素信号转导的药物筛选模型的建立[D];南京师范大学;2005年
3 刘世伟;载基因壳聚糖纳米粒的初步研究[D];四川大学;2005年
4 刘君;携带血管生成素-1基因重组腺病毒载体的构建及修饰骨髓间充质干细胞的实验研究[D];福建医科大学;2010年
5 邱俊钦;人骨形态蛋白-2基因重组腺病毒载体的构建及修饰骨髓间充质干细胞的实验研究[D];福建医科大学;2011年
6 乔羽;TLR诱导NF-κB活化上调NLRP3表达的机制研究[D];山东大学;2012年
7 张兴海;人胆固醇酯水解酶重组腺病毒载体的构建[D];辽宁医学院;2011年
8 陈水木;结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒载体的构建及表达[D];西南大学;2008年
9 单连华;FoxM1相关重组腺病毒载体小试生产及初步质量控制研究[D];湖南大学;2011年
10 周建民;人SCL基因重组腺病毒表达载体的构建[D];石河子大学;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026