收藏本站
《华中科技大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞胆碱能受体特性的研究

朱云  
【摘要】: 第一部分Ⅰ型前庭毛细胞改良分离法 目的探讨一种能提供更多数量并更长时间保留单离豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞(VHCⅠ)细胞活性的分离方法。 方法将耳廓反射正常的杂色豚鼠随机分为4组,每组12只,分别为0.25%胶原酶Ⅳ+常用分离法组(A组),0.05%胰蛋白酶+常用分离法组(B组),0.25%胶原酶Ⅳ+改良分离法组(C组)和0.05%胰蛋白酶+改良分离法组(D组)分离豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞,通过光镜、膜片钳、胞内钙成像等方法观察、鉴定和评价VHCⅠ活性。 结果A组平均每耳分离出存活单离VHCⅠ25个,镜下可见成簇的细胞团块,3h后存活细胞约14个,6h后存活细胞约8个,3h膜片钳测得静息电位平均为-55±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为105±15nmol/ L; B组平均每耳分离出存活单离VHCⅠ40个, 3h后存活细胞约19个,6h后存活细胞约6个,3h膜片钳测得静息电位平均为-60±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为95±10nmol/ L; C组平均每耳分离出存活单离VHCⅠ24个,3h后存活细胞约17个,6h后存活细胞约11个,3h膜片钳测得静息电位平均为-55±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为95±15nmol/ L;D组平均每耳分离出VHCⅠ42个,镜下成簇细胞团块较少,细胞与组织离解充分,3h后存活细胞约32个,6h后存活细胞约23个, 3h膜片钳测得静息电位平均为-60±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为90±10nmol/ L,且胞内钙离子浓度更稳定。 结论以胰蛋白酶酶解结合改良式液体外加机械分离技术分离方法简便易行,能提供足够量的存活时间较长的单离豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞,适用于对细胞活性要求较高的实验如膜片钳电生理研究等。 第二部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上存在胆碱能受体通道 目的探讨豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上有无胆碱能受体存在。 方法应用全细胞膜片钳技术检测豚鼠急性分离的Ⅰ型前庭毛细胞(vestibular hair cell typeⅠ, VHCⅠ)对乙酰胆碱(acetylcholine , ACh)的反应特性及其浓度依赖性。 结果7.5%(21/279)的Ⅰ型前庭毛细胞对10~1000μmol/L的ACh敏感,对ACh的反应呈浓度依赖性(EC50=63.78±2.31μmol/L)。 结论部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上存在胆碱能受体,胞外给予ACh(10~1000μmol/L)可激活一持久缓慢的外向电流,Ⅰ型前庭毛细胞的胆碱能受体通道对于ACh的作用呈现浓度依赖性。 第三部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱能受体通道电生理特性的研究 目的对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱能受体介导的离子通道的特性进行研究。 方法应用全细胞膜片钳技术,检测豚鼠急性分离的Ⅰ型前庭毛细胞(vestibular hair cell typeⅠ, VHCⅠ)对乙酰胆碱(acetylcholine , ACh)的电流特性。 结果豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱受体诱发电流为非电压依赖性。在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol/L乙酰胆碱激活一持久缓慢的外向电流,电流幅值为170±15pA。VHCⅠ的再次激活时间不小于1min。在长时间暴露在ACh的情况下,受体离子通道不会发生自发性关闭。 结论胞外给予ACh(10~1000μmol/L)部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上可激活一持久缓慢的外向电流,Ⅰ型前庭毛细胞的胆碱能受体通道对于ACh的作用呈现外钙依赖性,非电压依赖性或失敏性。 第四部分胆碱能激动剂对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞内钙离子浓度的影响 目的通过观察胆碱能受体激动剂对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞(VHCⅠ)胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]_i)的影响,探讨前庭毛细胞膜所存在的胆碱能受体及其分型,检验该细胞上胆碱能受体的脱敏现象。 方法用胰蛋白酶消化结合机械分离法,分离豚鼠VHCⅠ,荧光探针Fura-2染色后在荧光倒置显微镜下记录VHCⅠ胞内游离钙离子浓度的动态变化。 结果①非选择性胆碱能受体激动剂乙酰胆碱(ACh)、M型胆碱能受体激动剂毒蕈碱(muscarine)在正常细胞外液中均可引起大部分(21/25, 14/18)单离VHCⅠ[Ca~(2+)]_i的升高,但无钙外液中ACh、muscarine仅使少部分(3/20,2/16)VHCⅠ[Ca~(2+)]_i升高且作用减弱;正常外液中,N型受体激动剂尼古丁(nicotine)仅在高浓度(≥10 mmol/L)时引起部分(7/32) VHCⅠ[Ca~(2+)]_i升高,在低浓度时对胞内钙离子浓度影响不明显,无钙外液中,10 mmol/L nicotine对胞内钙离子浓度影响不明显。②ACh引起VHCⅠ内[Ca~(2+)]_i升高在同一细胞可重复出现,不存在脱敏现象③M型胆碱能受体拮抗剂阿托品(atropine)可抑制ACh引起的VHCⅠ[Ca~(2+)]_i的升高,N型胆碱能受体拮抗剂筒箭毒素(d-TC)对ACh引起的VHCⅠ[Ca~(2+)]_i的升高具有竞争性抑制作用。④分别以m1、m2、m3、m4型胆碱能受体拮抗剂pirenzepine、methoctramine、4-DAMP、tropicamide预孵育VHCⅠ5min后胞外给予ACh,均可引起[Ca~(2+)]_i ratio值升高幅度降低,但pirenzepine、4-DAMP和tropicamide对ACh对再次引起VHCⅠ[Ca~(2+)]_i ratio值升高的抑制作用不明显,methoctramine预孵育后细胞的[Ca~(2+)]_i ratio的升高幅度较首次正常外液中给予100μmol/L ACh后[Ca~(2+)]_i ratio值升高幅度降低约35±10%。 结论豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞膜上存在M型和N型两种亚型的胆碱能受体,ACh对VHCⅠ内[Ca~(2+)]_i升高的作用主要以激动m2型胆碱能受体为主;胞外钙内流是[Ca~(2+)]_i升高的主要途径;豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞膜上的胆碱能受体对乙酰胆碱无脱敏现象。 第五部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上乙酰胆碱敏感性电流的胞内信号转导机制 目的本文探讨了豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱能受体介导的乙酰胆碱敏感性电流胞内信号转导机制。 方法应用膜片钳技术检测急性分离的豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞(vestibular hair cell typeⅠ, VHCⅠ)上乙酰胆碱敏感性电流的胞内信号转导机制。 结果在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol/L乙酰胆碱在豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上激活一持久缓慢的外向电流,大电导钙依赖性钾通道(BK)选择性阻断剂北非蝎毒素(CTX)可大幅度抑制IACh,小电导钙依赖性钾通道(SK)选择性阻断剂蜂毒明肽(apamin)对IACh的影响不明显,IACh可被M型胆碱能受体拮抗剂阿托品(atropine)和N型胆碱能受体拮抗剂筒箭毒素(d-TC)竞争性抑制; m2型胆碱能受体选择性拮抗剂methoctramine可抑制VHCⅠ上引发的IACh,m1、、m3、m4型胆碱能受体拮抗剂pirenzepine、4-DAMP、tropicamide对VHCⅠ上IACh作用不明显;G蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX)可使IACh幅值减小,非水解性GTP类似物GTP-γ-s可增大IACh幅值; IP3受体拮抗剂肝素(heparin),PKG抑制剂KT5823,PKC特异选择性抑制剂BIM对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上IACh的影响不明显,PKA抑制剂H-89可明显抑制IACh,胞外应用PKA激动剂forskolin可激活一类似IACh电流;胞外应用cAMP膜可渗透性类似物db-cAMP可激活一类似IACh电流,cGMP膜可渗透性类似物8-BrcGMP不能产生类似电流,PLC抑制剂U73122对IACh的作用不明显。 结论ACh在VHCⅠ上主要作用于m2型胆碱能受体,激活一BK电流,该BK电流在胞内由m2型胆碱能受体偶联的G蛋白-cAMP-PKA通路介导。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R764

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 韩维举,张素珍,韩东一,姜泗长,杨伟炎,李楠;胆碱能受体激动剂对豚鼠离体前庭毛细胞内钙离子浓度的影响[J];军医进修学院学报;2001年01期
2 郭长凯;张松;孔维佳;李擎天;李之望;;阳离子对豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性电流的调制[J];生理学报;2006年02期
3 姚琦;孔维佳;程华茂;吴婷婷;夏交;朱云;;N型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠内耳耳蜗及前庭中的表达[J];听力学及言语疾病杂志;2006年03期
4 郭长凯;张松;孔维佳;张宇;张建;李擎天;;豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱敏感性钾电流的钙离子依赖性[J];中华耳鼻咽喉头颈外科杂志;2006年05期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 仲伟国;朱海;;罗库溴铵和顺式阿曲库铵对分娩期大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响[J];第二军医大学学报;2011年06期
2 杨军,汪吉宝,余青松,师洪,李桂榕;小鸡单离听毛细胞的分离及其形态学观察[J];临床耳鼻咽喉科杂志;1997年08期
3 刘群;祝红芳;;惯性时滞神经网络共振余维二分岔[J];南昌大学学报(理科版);2009年05期
4 徐三华;赵丽萍;冯荦;程洁;高蓉;肖杭;;Bukatoxin对大鼠背根神经节神经元河豚毒素不敏感型钠离子通道电流的影响[J];南京医科大学学报(自然科学版);2009年02期
5 Francesco Moccia;Roberto Berra-Romani;Franco Tanzi;;Update on vascular endothelial Ca~(2+) signalling:A tale of ion channels,pumps and transporters[J];World Journal of Biological Chemistry;2012年07期
6 朱云;孔维佳;夏交;张宇;程华茂;郭长凯;;豚鼠I型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性[J];生理学报;2008年03期
7 陈良;贺明;王武庆;;庆大霉素对水平半规管壶腹嵴的高频旋转感受功能损伤及其形态学基础[J];生理学报;2009年06期
8 朱云;孔维佳;夏交;姚琦;郭长凯;;豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞改良分离法[J];听力学及言语疾病杂志;2008年03期
9 陈燕;赵春玲;;烟碱型乙酰胆碱受体在认知功能中的作用[J];国际病理科学与临床杂志;2008年02期
10 徐有秋;心肌细胞电活动的离子流基础[J];心电学杂志;1986年03期
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 刘群;外部激励和惯性项对时滞神经网络动力学行为的影响研究[D];重庆大学;2008年
2 康喜讯;前庭椭圆囊Ⅰ型毛细胞钾通道[D];华中科技大学;2008年
3 徐添颖;尼古丁对血管功能和胰岛素敏感性的影响及机制研究[D];第二军医大学;2010年
4 李琪;尼古丁在吸烟导致气道慢性炎症中的独特效应[D];重庆医科大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前9条
1 燕兰云;阿米替林对大鼠皮层神经元钠离子通道电流及其mRNA的影响[D];南京医科大学;2010年
2 崔艺峰;不饱和脂肪酸在牵张增强豚鼠胃窦平滑肌细胞毒蕈碱电流中的作用[D];延边大学;2003年
3 赵真;ACH、TH及CGRP在大鼠面神经核团中的分布[D];第四军医大学;2008年
4 朱荣华;庆大霉素对耳蜗血管纹细胞ET-A表达的影响及阿魏酸钠的保护作用[D];山东大学;2010年
5 粘彬;清醒大鼠急性低血压兴奋前庭神经核的NMDA受体机制研究[D];延边大学;2010年
6 陈良;庆大霉素对水平半规管壶腹嵴的高频旋转感受功能损伤及其形态学基础[D];复旦大学;2010年
7 何跃军;人脑内尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)的表达及其分布的三维重建研究[D];南华大学;2010年
8 邓青山;α7烟碱型乙酰胆碱能受体在人颅内囊性动脉瘤中的表达变化及意义[D];泸州医学院;2012年
9 李宏杰;牛磺酸镁对大鼠心肌细胞异常钾离子通道影响的研究[D];天津医科大学;2012年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 李国华,李之望,王士端,魏劲波,郑先科;通过膜片钳玻璃微电极内插管进行胞内透析[J];生理学报;2002年02期
2 韩维举,张素珍,姜泗长,杨伟炎,韩东一;豚鼠壶腹嵴毛细胞内钙离子活动及ATP的影响[J];中华耳鼻咽喉科杂志;1999年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 韩维举,张素珍,韩东一,姜泗长,杨伟炎,李楠;胆碱能受体激动剂对豚鼠离体前庭毛细胞内钙离子浓度的影响[J];军医进修学院学报;2001年01期
2 师洪;前庭毛细胞分离法探讨[J];临床耳鼻咽喉科杂志;1994年02期
3 郭长凯;张松;孔维佳;张宇;张建;李擎天;;豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱敏感性钾电流的钙离子依赖性[J];中华耳鼻咽喉头颈外科杂志;2006年05期
4 郭长凯;余青松;孔维佳;李冠乔;李擎天;;豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性BK电流[J];中国药理学通报;2006年11期
5 杨立国;;乳内动脉M1胆碱能受体功能的研究[J];黑龙江医药;2010年04期
6 韩维举,张素珍,韩东一,姜泗长,杨伟炎;胆碱能受体激动剂引起豚鼠离体前庭毛细胞内钙离子浓度升高(英文)[J];Chinese Medical Journal;2001年07期
7 余青松,师洪,汪吉宝,李桂榕;豚鼠单个离体前庭毛细胞的光镜观察[J];临床耳鼻咽喉科杂志;1995年04期
8 郭长凯,孔维佳;豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性[J];中华耳科学杂志;2003年02期
9 许荣廷;邹艳果;;胆碱能受体阻滞剂救治急危重病应用评价[J];世界急危重病医学杂志;2007年02期
10 李继;邹黎明;;胆碱能受体和肾上腺素能受体磷酸化的调节作用机制研究[J];沈阳医学院学报;2009年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 汤燕平;王建国;;乙酰胆碱对胃上皮细胞胆碱能受体α亚单位的影响[A];中国生理学会第21届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2002年
2 李艳青;陈旭辉;李明;马兆鑫;黄平;;“截敏祛风汤”对变应性鼻炎大鼠鼻粘膜组织中乙酰胆碱的影响[A];中国中西医结合学会耳鼻喉科专业委员会第九次全国学术会议论文汇编[C];2009年
3 臧伟进;孙蕾;吕军;于晓江;朱树明;贾冰;李冬玲;;腺苷和乙酰胆碱对缺血心肌的保护作用及其机制[A];第九届全国心血管药理学术会议论文集[C];2007年
4 田金洲;杨承芝;杨惠民;袁致祥;商宪敏;胡玉宁;盛彤;陈勇;宋冰;张海滨;;复方大黄制剂对老龄小鼠大脑皮质和海马ChAT、AchE活性及Ach含量的影响[A];中医药优秀论文选(上)[C];2009年
5 王俊英;陈淑萍;高永辉;刘俊岭;;重复电针对慢性神经痛大鼠海马胆碱能神经活动的影响[A];中国针灸学会2009学术年会论文集(上集)[C];2009年
6 颜玉莲;杨健;;二丙酰基莲心碱对猪冠状动脉条的影响[A];中华中医药学会中成药学术研讨会论文集[C];2007年
7 郑筱祥;黄文高;陈安良;;人-机-环境系统可靠性评价方法的研究[A];第二届全国人—机—环境系统工程学术会议论文集[C];1995年
8 崔岚巍;;新生鼠大脑皮层神经元电压门控钾通道的乙酰胆碱调控机制[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年
9 侯红梅;;长托宁治疗有机磷农药中毒的护理[A];外科急危重症监护专科知识培训暨学术交流会论文集[C];2008年
10 吕荣;姜文凯;;不同频率电刺激下大鼠腓肠肌神经肌肉接头处乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱受体的变化[A];2002年第9届全国运动医学学术会议论文摘要汇编[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 鲍永福;老人健脑要做到“十多”[N];中国医药报;2001年
2 记者  毛黎;苹果产品能促进大脑功能[N];科技日报;2006年
3 白毅;突触形成的“阴阳”调和机制被揭示[N];中国医药报;2007年
4 郭伽;补充胆碱可增强记忆力[N];健康报;2006年
5 孙庆伟;人体水平衡的调节[N];家庭医生报;2007年
6 孙庆伟;人体内的钠与水肿、脱水的关系[N];家庭医生报;2007年
7 洪秀;源于药物的老人尿失禁[N];民族医药报;2001年
8 许贤豪 谢琰臣 俞忠良;治疗老年性痴呆四大设想[N];健康报;2004年
9 于峰;运动后为何皮肤发痒[N];大众卫生报;2006年
10 华林;服氯波必利查查神经系统[N];医药养生保健报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 朱云;豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞胆碱能受体特性的研究[D];华中科技大学;2008年
2 王懿;豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞M型胆碱能受体介导的胆碱能抑制机制的研究[D];华中科技大学;2012年
3 王国鹏;链霉素损伤后小鼠前庭毛细胞再生和神经支配[D];华中科技大学;2010年
4 温晓明;淋巴细胞非神经性胆碱能受体药理学特征的研究[D];中国协和医科大学;2006年
5 刘俊;大鼠内耳感觉上皮细胞原代培养体系及椭圆囊感觉上皮细胞永生化细胞系的建立与毛细胞再生[D];华中科技大学;2006年
6 程华茂;大鼠前庭毛细胞神经递质受体分布及功能[D];华中科技大学;2006年
7 康喜讯;前庭椭圆囊Ⅰ型毛细胞钾通道[D];华中科技大学;2008年
8 孙大为;大鼠前庭内侧核胆碱能受体和γ-氨基丁酸受体介导的钙离子荧光显像及信息转导机制研究[D];华中科技大学;2007年
9 王秀丽;M胆碱能受体对脊髓Ⅱ板层甘氨酸能神经元冲动调节机制的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
10 刘国清;麻黄汤组成原理研究[D];第一军医大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 秦石;胆碱能受体和肾上腺素能受体磷酸化的调节作用机制研究[D];吉林大学;2008年
2 王尧;自主神经系统在心房钠尿肽分泌调节中的作用[D];泰山医学院;2009年
3 董文哲;增加乙酰胆碱对缺血性脑损伤的保护作用研究[D];第二军医大学;2012年
4 王玉江;利用细胞内钙离子的浓度变化检测乙酰胆碱[D];山东大学;2006年
5 亓磊;钙离子对孤立肌细胞ACh自发分泌作用机理的研究[D];清华大学;2006年
6 李云;蛋氨酸对抗和保护化疗药物引起的内耳毛细胞损伤和死亡作用的研究[D];河北医科大学;2008年
7 周国勇;卡巴胆碱对脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬细胞释放炎症细胞因子的影响及其受体研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2007年
8 李彩丽;匹维溴铵对人离体横结肠肌条的作用[D];华中科技大学;2006年
9 黄燕;大鼠皮层神经元和骨骼肌细胞电生理特性的比较[D];泰山医学院;2008年
10 田芙蓉;G蛋白βγ亚基影响G蛋白偶联受体磷酸化的作用研究[D];吉林大学;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026