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《华中科技大学》 2009年
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醛固酮合酶和11-β羟化酶基因多态性与原发性醛固酮增多症发病风险的相关性研究

张国玺  
【摘要】: 背景 原发性醛固酮增多症(Primary aldosteronism,PA)是最常见的继发性高血压(Secondary Hypertension,SH)病因之一,以醛固酮的非抑制性自主高分泌紊乱为特征,可以引起低肾素、低血钾、钠水潴留和高血压等症候群。醛固酮瘤(Aldosterone-Producing Adenoma,APA)是PA最常见的亚型,约占PA 60%,其次是特发性醛固酮增多症(Idiopathic Hyperaldosteronism,IHA),约占PA 30%。醛固酮(Aldodosterone,ALD)在PA的发生、发展过程中扮演着非常重要的角色。ALD合成的最后关键步骤包括:脱氧皮质酮向皮质酮转化的11-β羟化反应、皮质酮转化为18-羟皮质酮的18-羟化反应和18-羟皮质酮转化为ALD的18-氧化反应。上述三个步骤均由醛固酮合酶(Aldosterone synthase)催化。编码该酶的基因是CYP11B2。在肾上腺皮质的束状带,11-脱氧皮质醇在11-β羟化酶的作用下产生皮质醇,编码11-β羟化酶的基因是CYP11B1。研究发现,CYP11B2和CYP11B1的几个常见的多态性位点(如:-344T/C、intron 2W/C、K173R、2803A/G等)与原发性高血压(Essential Hypertension,EH)相关,并影响ALD的合成。近年来,有关CYP11B2基因多态性与PA相关性研究的报道较少,且多为小样本研究。另外,尚未见到CYP11B1基因多态性与PA相关性研究的报道。 方法 1.收集118例正常人血液标本,134例APA患者肾上腺皮质腺瘤标本(88个冰冻标本和46个石蜡标本)和45例IHA患者肾上腺标本(31个冰冻标本和14个石蜡标本)。采用DNeasy Blood Tissue试剂盒(Qiagen公司)提取标本DNA,-20℃保存。 2.根据相关文献和公共SNP数据库(http://ncbi.nlm.nih.gov/SNP/和http://www.hapmap.org/)选择CYP11B2和CYP11B1基因中频数≥0.05、且文献报道与高血压病相关的6个位点(rs1799998、rs4539、rs6414、intron 2W/C、rs6410和rs6387)。 3.对CYP11B2和CYP11B1基因的6个多态性位点进行检测。其中,intron 2W/C采用2个独立的PCR反应,其余位点均先后采用:聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length PolymorphismPCR-RFLP)、MGB-Taqman探针法和测序法。并采用Haploview 4.0分析连锁不平衡(Linkage Disequilibrium,LD),在R statistics program 2.7.0程序包中使用SNPassoc1.5-3分析Hardy-Weinberg平衡。 4.在R statistics program 2.7.0程序包中使用SNPassoc 1.5-3和Haplo.stats 1.3.8软件分析CYP11B2和CYP11B1基因多态性位点与PA的关系。 结果 1.基因型鉴定:本研究所选择的6个双等位基因多态性位点除rs6414外,均获得成功检测。各基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。rs6410和rs6387位点之间的LD最为强烈(D’0.66),LD最弱的是rs4539和intron 2 W/C位点(D’0.06)。 2.比较PCR-RFLP法和MGB-Taqman探针法的优缺点:检测rs1799998和rs4539多态性位点时,MGB-Taqman探针法的误差率明显低于PCR-RFLP法(x~2=7.39,P=0.007;x~2=6.34,P=0.012)。采用MGB-Taqman探针法检测rs1799998和rs4539位点平均所用时间(1h左右)较PCR-RFLP法(6h左右)短,但其费用(15.00元人民币左右)较PCR-RFLP法(rs1799998位点为6.00,rs4539位点为12.00元人民币左右)高。 3.CYP11B2和CYP11B1基因型和PA的关系:APA和IHA组中rs6410位点的A等位基因频数显著高于对照组(P=1.09×10~(-5),P=0.015)。与对照组相比,APA组中rs6410位点纯合子AA基因型和杂合子AG基因型比例较高(P=2.19×10~(-4))。与对照组相比,IHA组中纯合子AA基因型和杂合子AG基因型频数仅在年龄、性别和BMI校正后具有统计学意义(OR=4.06 95%CI 1.31-12.66;OR=2.41,95%CI 1.02-5.72)。本研究中,未发现rs4539、intron 2 W/C和rs1799998单个多态性位点与APA和IHA相关。 4.CYP11B2和CYP11B1单体型和APA的关系:与对照组相比,AAAWT单体型频数在APA中显著增高(Empirical P=5.0×10~(-5))。相反,GGAWT单体型频数在APA中显著降低(Empirical P=1.0×10~(-4))。以年龄、性别和BMI进行校正后,发现AAAWT单体型与APA的发病风险增高相关(OR=1.44,95%CI 1.19-1.76),而GGAWT单体型则与APA的发病危险性降低相关(OR=0.73,95%CI 0.55-0.97)。 5.CYP11B2-CYP11B1单体型与IHA的关系:与对照组相比,IHA组单体型AAAWT频数增高(P=0.002)。以年龄、性别和BMI进行校正后,发现AAAWT,AGGWT和AGAWC单体型与IHA的发病危险性增高相关(OR=1.55,95%CI 1.23-1.96;OR=1.49,95%CI 1.17-1.89;OR=1.40,95%CI 1.04-1.88)。而且,AAAWT在IHA中增高的幅度大于在APA中增高的幅度(OR=1.55比OR=1.44)。 结论 1.在选择基因多态性检测方法时,应该根据所选位点、样本量大小和实验室经费等情况综合考虑,选择最为合适的检测方法。MGB-Taqman探针法耗时少,效率高,准确性强。适用于大批量基因多态性检测。PCR-RFLP法适应于样本量小,内切酶价格低的多态性位点检测。 2.CYP11B2和CYP11B1基因多态性与原发性醛固酮增多症的发病显著相关。通过对二者多态性位点的检测,有可能为预测原发性醛固酮增多症的发病提供一定的参考价值。 3.本研究为进一步研究原发性醛固酮增多症的发病机制以及对其开展基因治疗提供了新的线索和思路。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R586.24

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