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《华中科技大学》 2009年
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超声微泡靶向增强基因转染的研究

陈智毅  
【摘要】: 随着分子生物学及生物技术的迅速发展,近年来基因治疗的基础研究与应用得到了长足的进步。在基因疗法的研究中,基因传输方法是成功进行基因治疗的一个关键步骤,其中非侵袭、靶向的基因输送系统因其诸多优点成为基因疗法研究中的一个热点,在临床上具有重要的潜在应用价值。虽然传统的病毒基因载体具有较高的基因转染效率,但该类方法的安全性和长期疗效受到质疑,限制了其临床应用。近几年,非病毒基因载体引起了研究者的关注并得到了广泛研究。但目前的研究表明,单纯的非病毒载体基因转染率不高,导致基因治疗效果明显受限。超声靶向微泡破坏技术(Ultrasound-targetedmicrobubble destruction,UTMD)是一种靶向、高效、有广阔应用前景的非病毒基因输送新策略,其通过诱发细胞膜声孔作用,增加膜通透性,进而有效促进大分子物质的胞内传输,且可避免其他基因传输方法的副作用。在该类方法的研究中,UTMD的参数设置与优化组合对基因转染效率有至关重要的影响。本论文将对UTMD的参数进行详细分析与优化,为靶向、高效、无创的基因治疗研究提供一种可行的实验方案;同时尝试将物理(UTMD)和化学(PEI)的基因转染策略有机地结合起来,探究一种有效的基因传输与基因转染方法;尝试运用UTMD转染靶向Survivin基因的短发夹状RNA干扰质粒,分析基因沉默效应、凋亡诱导及增殖抑制作用,开创癌症基因治疗的新篇章。本文包括以下三部分: 第一部分超声靶向微泡破坏参数设置与优化增强基因转染的研究 目的①探讨不同超声及转染参数、细胞培养方式对细胞活力、基因传输和声孔作用的影响,优化超声靶向微泡破坏(UTMD)参数,减少对细胞活力利质粒完整性的影响;②比较不同声学微泡对体外基因转染的作用及其安全性;③探讨优化的UTMD参数对裸鼠人宫颈癌(Hela)皮下移植瘤基因的靶向传输效率。方法体外研究:①悬浮培养或贴壁培养Hela细胞,设置不同超声强度、占空比及辐照时间,比较其对细胞活力及红色荧光蛋白基因(DsRed)表达效率的影响;②显微镜和扫描电镜观察细胞形态及细胞膜表面的超微结构;③系统比较不同转染参数组合、不同质粒[DsRed利荧光素酶质粒(pCMV-LUC)]对细胞活力及基因表达效率的影响,分析UTMD对基因转染的增强作用,琼脂糖凝胶电泳分析质粒完整性;④分析脂质体微泡(LM)的增效作用,对微泡浓度、超声参数进行优化,运用最优参数对不同细胞系(HepG_2、Ishikawa、MCF-7和B16-F10)行超声处理,并与Sono Vue微泡、聚乙烯亚胺(PEI)介导的基因转染进行比较。体内研究:将两种报告质粒(EGFP、DsRed)经裸鼠尾静脉注入,对基因表达持续时间(1~7 d)、质粒用量(20~50μg)、靶向性和安全性进行分析。结果体外研究:①高声强和高占空比显著降低细胞存活率(P<0.01),导致细胞脱离。细胞培养方式和三种超声参数均有显著的交互作用(P<0.01);贴壁培养时,细胞活力随着占空比的增加、辐照时间的延长而逐步降低。悬浮培养时,经相同超声参数转染的细胞数目明显增加,存活率无明显下降;②电镜结果显示,适当条件的超声辐照能导致细胞表面出现可逆性孔道。悬液培养的细胞经1.0 W/cm~2、20%占空比的辐照3 min后,声孔作用最强;③当质粒浓度达到30μg/孔时,两种质粒转染率均最高。与单纯超声辐照相比,UTMD可显著提高基因转染效率(P<0.01)。④电泳结果表明,质粒DNA结构的完整性不受优化参数影响;⑤超声辐照联合LM处理后基因转染率显著增加(P<0.01);当培养细胞暴露于最优条件时,不同细胞类型对超声的反应性不同。体内研究:P+UTMD组内荧光表达显著高于P组、P+US组或P+LM组,差异均有统计学意义(p<0.01),基因表达的最佳时间是第3 d(P<0.01),两种不同报告基因的转染率较一致,非靶向器官未见明显基因表达且未观察到明显的组织损伤,结论①不同超声和转染参数、培养方式对细胞活力和基因传输效率有较大影响,对其优化后可产生较强的声孔作用,减少细胞损伤;②声学微泡对超声介导基因转染有显著的增效作用,UTMD是一种有效的体外基因输送方法;③UTMD能显著增加体内报告基因转染,是一种高效、非侵袭性的基因转染方法。 第二部分超声靶向微泡破坏联合聚乙烯亚胺增强基因转染的研究 目的①分析UTMD联合PEI增强癌细胞基因转染的最优体外条件及协同作用;②探讨UTMD联合PEI增强裸鼠移植瘤基因输送的可行性和应用价值。方法体外研究:①制备PEI/pCMV-LUC复合物用于乳腺癌细胞(MCF-7)基因转染,以不同方式孵育微泡/转染复合物,通过荧光素酶活性和细胞存活率测定,对超声辐照参数进行优化,对质粒浓度、孵育时间、血清、溶媒类型、培养基体积等因素进行分析。②将不同质粒DNA(DsRed、pCMV-LUC)与不同分子量PEI(25 kDa、750 kDa)以不同的N/P比制备PEI/DNA复合物,利用凝胶阻滞实验分析PEI/DNA复合物的混合比例,MTT法测定PEI的细胞毒性,评价不同分子量PEI对基因转染的影响及超声辐照的增强作用。体内研究:经荷瘤裸鼠尾静脉分别注入PBS、质粒、质粒+Sono Vue微泡、PEI/DNA复合物+SonoVue微泡,仅对一侧肿瘤行超声辐照,另一侧肿瘤作为对照,对基因转染和组织学检查进行分析。结果体外研究:①适当条件的超声辐照可促进PEI/DNA复合物转染,UTMD联合PEI的转染效率显著高于单纯超声辐照和PEI转染(P<0.01)。超声辐照前细胞与PEI/DNA复合物共孵育2 h时,荧光素酶活性显著增强(P<0.01)。②琼脂糖凝胶电泳显示,N/P比≥3时,PEI可有效地缩合质粒DNA,两种PEI及两种质粒DNA的电泳情况相似。细胞毒性与PEI浓度相关。②单独超声辐照能提高裸质粒和PEI/DNA复合物的荧光素酶活性(P<0.05),但前者的增加幅度显著小于后者(P<0.05),25 kDa显著优于750 kDa(P<0.01)。体内研究:UTMD联合PEI可显著增强基因转染,受辐照移植瘤的荧光素酶活性增加了10倍(P<0.01);与非联合PEI时比较,荧光素酶表达增加了111倍(P<0.01)。无论有否超声照射,裸鼠其他器官组织中均无明显的基因表达(P>0.05),且未观察到明显的组织损伤。结论①UTMD联合PEI对基因转染有协同作用,是一种增强质粒DNA基因表达简单而有应用前景的方法,优化的超声和转染参数能显著提高体外癌细胞的基因表达效率。②UTMD联合PEI可显著增强报告基因在肿瘤组织的靶向传输利转染,是一种很有前景、新型而安全的体内基因输送方法,为基因治疗提供一种高效的新方法。 第三部分超声靶向微泡破坏联合RNAi沉默Survivin表达及诱导细胞凋亡的研究 目的①构建靶向Survivin基因的shRNA真核表达质粒,研究RNA干扰技术(RNAi)对凋亡抑制因子Survivin的降调节作用;②通过UTMD联合RNAi,观察体内外Survivin基因的沉默效应、细胞凋亡的诱导效应和增殖抑制作用。方法①构建三个靶向Survivin基因的shRNA真核表达质粒(pSIREN/S1/S2/S3)和对照质粒(pSIREN/con)。②体外研究:通过UTMD或脂质体转染筛选,将最优重组质粒进行详细研究,应用FITC-annexin V和7-AAD双染、DNA ladder分析细胞凋亡,RT-PCR和蛋白质印迹检测mRNA及蛋白表达的变化。③体内研究:将荷瘤裸鼠分三组:质粒+超声辐照组(P+US),质粒+微泡+超声辐照组(P+UTMD),对照组(C)。对组织样本行冰冻切片、组织学检查、采用免疫组化检测移植瘤Survivin、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Ki-67、核干细胞因子(NS)、p53蛋白在各组肿瘤标本中的表达,采用CD34标记、测定微血管密度(MVD),应用TUNEL法分析凋亡指数(AI)。结果①酶切和测序分析证实重组质粒构建成功。②体外研究:RT-PCR和蛋白质印迹法表明,pSIREN/S3的抑制效果最显著。流式细胞分析显示,P+L组的细胞凋亡率(31.58%±3.12%)显著高于各对照组(P<0.01),但仍低于P+UTMD组(43.86%±4.44%,P<0.01);DNA ladder显示,脂质体或UTMD转染处理后可检测到明显凋亡条带;P+UTMD组的Survivin mRNA及蛋白表达抑制率为83.33%±2.73%和79.67%±3.55%,均显著高于其他各组(P<0.01)。③体内研究:P+UTMD组的PCNA、Ki-67、Bcl-2、Survivin及NS蛋白表达下降,而Bax、Caspase-3和P53蛋白表达明显上调,MVD明显减少,AI明显增加,与C组及P+US组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Survivin可作为癌症基因治疗的理想靶标,UTMD联合shRNA干扰技术能显著阻抑靶基因Survivin的表达,有效诱导体内外细胞凋亡,抑制细胞增殖,为肿瘤基因治疗及研究提供有前景的新方法。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R450

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