重组腺相关病毒介导的转EB病毒潜伏期膜蛋白治疗鼻咽癌的试验研究
【摘要】：
背景和目标：鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方的常见肿瘤。EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)是鼻咽癌最重要的病因。鼻咽癌的组织中有EB病毒潜伏期膜蛋白1、2不同程度的表达。研究发现，很少的EB病毒携带者能产生LMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，这提示我们建立一个针对LMP1和LMP2的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，对鼻咽癌患者应该有长期的治疗效果。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是目前最常用的基因治疗载体，它拥有一些独特的优点：可以携带基因转染分裂期和非分裂期细胞、无致病性、能驱动基因在体内长期、稳定的表达。在本研究中，我们利用腺相关病毒载体，以EB病毒潜伏期膜蛋白1、2的基因作为表位，并融合了热休克蛋白作为佐剂，构建了一种鼻咽癌疫苗。
方法：1．我们首先克隆了EB病毒LMP1、LMP2基因的编码序列，并构建pAAV-LMP2／1-hsp重组质粒，然后与重组腺相关病毒包装质粒pXX_2，辅助质粒phelper，通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞，包装制备rAAV-LMP2／1-hsp病毒，同时包装制备对照病毒rAAV-GFP，病毒经纯化后以斑点杂交方法检测其病毒滴度。2．SP2／0细胞转染了pCDNA3．1-LMP2质粒，然后通过G418(400ug／ml)筛选，得到稳定表达LMP2的阳性细胞株SP 2／0-LMP2。3．LMP2_(228-242)肽注射于新西兰白兔的皮下，6周后，收集血清、纯化后得到兔抗LMP2多克隆抗体。4．为确认rAAV转染细胞后嵌合基因是否有表达，我们用1×10~9的病毒颗粒感染293细胞，2天后提取蛋白，通过免疫印迹法检测嵌合基因的表达。5．我们采用了两个不同的免疫策略。第一种方法：首先肌肉注射rAAV-LMP2／1-hsp或rAAV GFP免疫BALB／c小鼠。3周后，动物皮下注射SP2／0-LMP2或SP2／0细胞成瘤，观察30天，定期测量肿瘤直径。第二种方法：首先BALB／c小鼠皮下注射SP2／0-LMP2或SP2／0细胞，10天后肌肉注射rAAV-LMP2／1-hsp或rAAV GFP免疫动物，定期测量肿瘤直径。6．为分析rAAV疫苗的细胞免疫反应，BALB／c小鼠分为3组，分别肌肉注射rAAV-LMP2／1-hsp、rAAVGFP或PBS，3周后杀死动物，取脾细胞。SP2／0-LMP2或SP2／0细胞作为靶细胞，小鼠脾细胞作为效应细胞，以LDH释放法测定细胞毒性T细胞功能。7．为研究rAAV疫苗的免疫机制，我们把BALB／c小鼠分为3组，分别肌肉注射rAAV-LMP2／1-hsp、rAAV GFP或PBS。3周后杀死动物，取脾细胞，分别以LMP2特异性表位肽或非特异性肽干预，培养4天后，以MTT法测定T细胞增殖。
结果：1．经过酶切鉴定、PCR、测序法证实重组腺相关病毒质粒pAAV-LMP2／1-hsp构建成功。2．免疫印迹法证实该病毒转染293细胞后可表达融合蛋白。3．先用rAAVLMP2／1-hsp或rAAV GFP免疫BALB／c小鼠，然后接种SP2／0或SP2／0-LMP2细胞，虽然各组都能成瘤，但是rAAV-LMP2／1-hsp组的肿瘤生长速度明显比其他各组缓慢，而其他各组之间无差异。第35天，rAAV LMP2／1-hsp免疫组的肿瘤体积大约是rAAV GFP免疫组的1／5。4．先接种SP2／0或SP2／0-LMP2细胞，然后用rAAVLMP2／1-hsp或rAAV GFP免疫BALB／c小鼠。rAAV-GFP免疫组的小鼠肿瘤进展迅速，在免疫的第20天全部死亡；而rAAV LMP2／1-hsp免疫组的小鼠肿瘤生长缓慢，生存时间明显延长。5．BALB／c小鼠接种rAAV-LMP2／1-hsp，rAAV-GFP或生理盐水，3周后杀死动物，分离培养脾细胞。用SP2／0-LMP2或SP2／0细胞作为靶细胞，小鼠脾细胞作为效应细胞，以LDH释放法测定细胞毒性T细胞功能，结果显示rAAV-LMP2／1-hsp免疫组的脾细胞在LMP2表位肽的刺激下裂解SP2／0-LMP2和SP2／0细胞，而其他各组不发生裂解。6．以MTT法测定T细胞增殖反应，结果显示来源于rAAV-E7CTL-hsp免疫组的小鼠T细胞在LMP2表位肽的刺激作用下发生增值，而其他组T细胞不增值。
结论：利用腺相关病毒载体成功构建了一种鼻咽癌疫苗，以EB病毒潜伏期膜蛋白1、2的基因作为表位，并融合了热休克蛋白作为佐剂，该疫苗可能通过诱导细胞毒性T细胞反应，发挥抗肿瘤的效应。该项研究有希望投入临床应用。
【关键词】：鼻咽癌 EB病毒 疫苗 重组腺相关病毒 【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R739.63
【目录】：
- 英文缩略词表5-6
- 摘要6-8
- ABSTRACT8-11
- 重组腺相关病毒介导的转EB病毒潜伏期膜蛋白治疗鼻咽癌的实验研究11-64
- 实验材料11-12
- 实验方法12-45
- 实验结果45-59
- 讨论59-62
- 参考文献62-64
- 全文总结64-65
- 综述65-92
- 附录92-100
- 撰写论文100-101
- 致谢101-102
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