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《华中科技大学》 2009年
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重组腺相关病毒介导的转EB病毒潜伏期膜蛋白治疗鼻咽癌的试验研究

潘建青  
【摘要】: 背景和目标:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方的常见肿瘤。EB病毒(Epstein Barr virus,EBV)是鼻咽癌最重要的病因。鼻咽癌的组织中有EB病毒潜伏期膜蛋白1、2不同程度的表达。研究发现,很少的EB病毒携带者能产生LMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),这提示我们建立一个针对LMP1和LMP2的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应,对鼻咽癌患者应该有长期的治疗效果。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是目前最常用的基因治疗载体,它拥有一些独特的优点:可以携带基因转染分裂期和非分裂期细胞、无致病性、能驱动基因在体内长期、稳定的表达。在本研究中,我们利用腺相关病毒载体,以EB病毒潜伏期膜蛋白1、2的基因作为表位,并融合了热休克蛋白作为佐剂,构建了一种鼻咽癌疫苗。 方法:1.我们首先克隆了EB病毒LMP1、LMP2基因的编码序列,并构建pAAV-LMP2/1-hsp重组质粒,然后与重组腺相关病毒包装质粒pXX_2,辅助质粒phelper,通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞,包装制备rAAV-LMP2/1-hsp病毒,同时包装制备对照病毒rAAV-GFP,病毒经纯化后以斑点杂交方法检测其病毒滴度。2.SP2/0细胞转染了pCDNA3.1-LMP2质粒,然后通过G418(400ug/ml)筛选,得到稳定表达LMP2的阳性细胞株SP 2/0-LMP2。3.LMP2_(228-242)肽注射于新西兰白兔的皮下,6周后,收集血清、纯化后得到兔抗LMP2多克隆抗体。4.为确认rAAV转染细胞后嵌合基因是否有表达,我们用1×10~9的病毒颗粒感染293细胞,2天后提取蛋白,通过免疫印迹法检测嵌合基因的表达。5.我们采用了两个不同的免疫策略。第一种方法:首先肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp或rAAV GFP免疫BALB/c小鼠。3周后,动物皮下注射SP2/0-LMP2或SP2/0细胞成瘤,观察30天,定期测量肿瘤直径。第二种方法:首先BALB/c小鼠皮下注射SP2/0-LMP2或SP2/0细胞,10天后肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp或rAAV GFP免疫动物,定期测量肿瘤直径。6.为分析rAAV疫苗的细胞免疫反应,BALB/c小鼠分为3组,分别肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp、rAAVGFP或PBS,3周后杀死动物,取脾细胞。SP2/0-LMP2或SP2/0细胞作为靶细胞,小鼠脾细胞作为效应细胞,以LDH释放法测定细胞毒性T细胞功能。7.为研究rAAV疫苗的免疫机制,我们把BALB/c小鼠分为3组,分别肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp、rAAV GFP或PBS。3周后杀死动物,取脾细胞,分别以LMP2特异性表位肽或非特异性肽干预,培养4天后,以MTT法测定T细胞增殖。 结果:1.经过酶切鉴定、PCR、测序法证实重组腺相关病毒质粒pAAV-LMP2/1-hsp构建成功。2.免疫印迹法证实该病毒转染293细胞后可表达融合蛋白。3.先用rAAVLMP2/1-hsp或rAAV GFP免疫BALB/c小鼠,然后接种SP2/0或SP2/0-LMP2细胞,虽然各组都能成瘤,但是rAAV-LMP2/1-hsp组的肿瘤生长速度明显比其他各组缓慢,而其他各组之间无差异。第35天,rAAV LMP2/1-hsp免疫组的肿瘤体积大约是rAAV GFP免疫组的1/5。4.先接种SP2/0或SP2/0-LMP2细胞,然后用rAAVLMP2/1-hsp或rAAV GFP免疫BALB/c小鼠。rAAV-GFP免疫组的小鼠肿瘤进展迅速,在免疫的第20天全部死亡;而rAAV LMP2/1-hsp免疫组的小鼠肿瘤生长缓慢,生存时间明显延长。5.BALB/c小鼠接种rAAV-LMP2/1-hsp,rAAV-GFP或生理盐水,3周后杀死动物,分离培养脾细胞。用SP2/0-LMP2或SP2/0细胞作为靶细胞,小鼠脾细胞作为效应细胞,以LDH释放法测定细胞毒性T细胞功能,结果显示rAAV-LMP2/1-hsp免疫组的脾细胞在LMP2表位肽的刺激下裂解SP2/0-LMP2和SP2/0细胞,而其他各组不发生裂解。6.以MTT法测定T细胞增殖反应,结果显示来源于rAAV-E7CTL-hsp免疫组的小鼠T细胞在LMP2表位肽的刺激作用下发生增值,而其他组T细胞不增值。 结论:利用腺相关病毒载体成功构建了一种鼻咽癌疫苗,以EB病毒潜伏期膜蛋白1、2的基因作为表位,并融合了热休克蛋白作为佐剂,该疫苗可能通过诱导细胞毒性T细胞反应,发挥抗肿瘤的效应。该项研究有希望投入临床应用。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R739.63

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【参考文献】
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