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《华中科技大学》 2009年
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黑素瘤中过度表达c-FLIP异常激活β-catenin/TCF路径的研究

杨井  
【摘要】: 第一部分c-FLIP、浆/核β-catenin的表达及二者表达的相关性研究 目的观察细胞型FAS结合蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白(cellular FADD-likeinterleukin -1βconvening enzyme inhibitory protein,c-FLIP)、浆/核β-连环蛋白(β-catenin)在恶性黑素瘤组织、色素痣、银屑病及正常包皮组织中的表达,探讨两者的相关性。 方法以20例色素痣组织及20例正常包皮作为对照,应用免疫组织化学方法检测77例恶性黑素瘤组织,20例银屑病组织中c-FLIP、浆/核β-catenin的表达,对蛋白表达行半定量分析。 结果c-FLIP、浆/核β-catenin、周期素蛋白D1(cyclinD1)在77例恶性黑素瘤组织中的阳性表达率分别为65.0%、32.5%和31.2%,且三者的表达有相关性;c-FLIP的表达在黑素瘤组织中明显增高,且与组织类型相关;在正常色素痣中c-FLIP、浆/核β-catenin及cyclinD1无阳性表达或偶见阳性表达。银屑病组织中c-FLIP的表达增强,与正常对照相比,差异有显著性;几无浆/核β-catenin的表达;在银屑病组织中未观察到三者有MM中的类似关系。 结论c-FLIP高表达可能参与MM的发生、发展;在MM中高表达的c-FLIP可能与β-catenin的浆/核表达有关,从而影响β-连环蛋白/T细胞因子(β-catenin/TCF)下游基因cyclinD1的表达。 第二部分pCMV-Tag2B-FLIP_(L/P43/S)以及c-FLIP-shRNA载体的构建和表达 目的构建细胞FLICE蛋白(c-FLIP)和pCMV-Tag2B融合蛋白基因的重组真核表达载体pCMV-Tag2B-FLIP_L、pCMV-Tag2B-FLIP_S和pCMV-Tag2B-FLIP_(p43)。并转染至A375细胞中进行表达,鉴定融合蛋白的生物学活性。针对c-FLIP各亚型共有靶点设计shRNA分子,连接于真核表达载体pSilencer 3.1-H1 neo,构建pSilencer-c-FLIP质粒,下调c-FLIP的表达。为后续实验奠定基础。 方法从白血病Jurkat细胞中提取总RNA,分离提取mRNA,逆转录获得cDNA。设计三对引物引入酶切位点xhoⅠ和EcoRI,再用PCR的方法,分别扩增FLIP_L、FLIP_(P43)和FLIP_S序列。将获得的基因克隆至pGEM-T载体(FLIP-T),转化大肠杆菌DH5a,进行蓝白筛选,挑取阳性克隆扩增。提取质粒以xhoⅠ、EcoRI双酶切鉴定,并测序证实正确后,亚克隆至pCMV-Tag 2B,获得pCMV-Tag 2B-FLIP_(L/P43/S),转染A375细胞,获得稳转细胞系。设计针对c-FLIP的shRNA,酶切pSilencer 3.1-H1 neo后,将合成的shRNA通过BamHⅠ和HindⅢ连接于载体,构建真核载体,表达siRNA。 结果测序结果表明获得了正确的FLIP_L、FLIP_(P43)和FLIP_S基因序列;亚克隆至pGEM-T载体后,xhoⅠ和EcoRI双酶切可见约1.4Kb、1.1Kb和0.6kb的小片段和约4.3Kb的大片段,与理论计算值相符,表明pCMV-Tag 2B-FLIP_L、pCMV-Tag 2B-FLIP_(P43)和pCMV-Tag 2B-FLIP_S真核表达载体构建成功;表达载体转染A375细胞,G418筛选后用westernblot、流式分析鉴定其为稳定转染细胞株。成功pSilencer-c-FLIP构建,转染入黑素瘤细胞中,能够下调c-FLIP各亚型的表达。 结论成功构建pCMV-Tag 2B-FLIP_(L/P43/S)融合蛋白的真核表达载体,融合蛋白可在A375细胞中表达;成功构建pSilencer-c-FLIP载体,在黑素瘤细胞中能够下调c-FLIP各亚型的表达,本实验为进一步研究FLIP对β-catenin/TCF通路的影响奠定基础。 第三部分c-FUP_(L/P43)通过β-catenin/TCF激活cyclinD1的表达 目的观察c-FLIP的改变是否激活β-catenin/TCF通路,引起下游基因的变化;观察c-FLIP各亚型在上述作用中的差异。 方法利用pCMV-Tag-2B-c-FLIP真核表达载体上调低表达c-FLIP的黑素瘤A375细胞系中各亚型c-FLIP的表达水平,用western blot及细胞免疫荧光观察β-catenin定量、定位的改变;用TOP/FOP双荧光报告基因分析观察转录因子TCF的活性,判断是否通过β-catenin/TCF路径启动下游基因的转录;western blot检测β-catenin/TCF路径下游基因cyclinD1蛋白水平的改变;比较c-FLIP各亚型在上述过程中的作用差异;同时利用pSilencer-c-FLIP载体下调c-FLIP各亚型的水平,观察对上述过程的影响,明确c-FLIP各亚型功能特异性。 结果在A375细胞中,高表达c-FLIP_(L/P43)可以增加胞核及胞浆中β-catenin的表达;通过TOP/FOP双荧光报告基因检测,证明确实通过β-catenin/TCF路径启动下游基因的转录;检测下游基因cyclinD1的蛋白水平明显升高。行RNA干扰c-FLIP的表达后,上述结果部分逆转。但在高表达c-FLIP_S的细胞中并未表现出上述现象。 结论过度表达c-FLIP_(L/P43)可以异常激活β-catenin/TCF路径,诱导下游基因的表达。 第四部分c-FLIP对A375细胞生物学特性的影响 目的观察c-FLIP各亚型对A375细胞的生长、增殖、凋亡及转化能力的影响。 方法在pCMV-Tag-2B-c-FLIP_(L/P43/S)稳定转染细胞中,运用绝对细胞计数对c-FLIP各亚型稳定转染细胞绘制生长曲线,比较其与对照组的差异;用MTT法检测各稳定转染细胞增殖能力的差异;用Annexin v/PI双染细胞,检测各组细胞凋亡率的差异;用双层软琼脂克隆形成实验检测各组细胞体外转化能力的差异。同时运用shRNA干扰,下调c-FLIP各亚型的表达,验证c-FLIP所产生的细胞生物学特异改变的特异性。 结果A375/c-FLIP_(L/p43/S)细胞的生长速度均快于A375/Control细胞,其中,A375/c-FLIP_L与A375/c-FLIP_(P43)细胞的生长速度基本一致,A375/c-FLIP_S较二者慢;行MTT法检测细胞增殖能力,与细胞生长曲线结果类似,A375/c-FLIP_(L/p43/S)细胞增殖能力强于A375/Control细胞,其中,A375/c-FLIP_S细胞增殖能力略低于A375/c-FLIP_L及A375/c-FLIP_(P43)细胞;Annexin v/PI双染检测细胞凋亡率,A375/c-FLIP_(L/p43/S)细胞略低于A375/Control细胞;行双层软琼脂克隆形成实验,A375/c-FLIP_(L/p43/S)细胞克隆形成率高于对照细胞,其中,A375/c-FLIP_L与A375/c-FLIP_(P43)细胞克隆形成率高于A375/c-FLIP_S细胞。用shRNA干扰,下调c-FLIP各亚型的表达,上述效应部分得到逆转。 结论c-FLIP各亚型均可以促进细胞生长、增殖及转化,其中c-FLIP_L及c-FLIP_(P43)的能力更强,但在抗凋亡效应中,c-FLIP的三种亚型未表现出显著差异。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R739.5

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