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《华中科技大学》 2009年
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产PUFAs转基因株的构建

李运涛  
【摘要】: 多不饱和脂肪酸(PUFAs),尤其是长链多不饱和脂肪酸,具有重要的生理与保健功能。目前,ω6系列的多不饱和脂肪酸主要来源是微生物发酵,ω3系列多不饱和脂肪酸主要来源于鱼油,鱼油来源有限,脂肪酸提取工艺复杂且难以保证纯度。ω6系列与ω3系列多不饱和脂肪酸目前都存在价格昂贵、不能满足市场需求的缺点。利用基因工程手段提高微生物中长链多不饱和脂肪酸的产量以及在油料作物中生产长链多不饱和脂肪酸,是两种有效的方法。本研究使用三角褐指藻的Δ6脱饱和酶基因、Δ6延长酶基因与Δ5脱饱和酶基因,利用可以体外构建多拷贝表达盒的酵母表达载体pAO815,构建了含有Δ6脱饱和酶基因、Δ6延长酶基因与Δ5脱饱和酶基因的多价表达载体(pAO1×D6E6D5),并构建了三个基因各有两个拷贝的表达载体(pAO2×D6E6D5),分别转化毕赤酵母,构建成产长链多不饱和脂肪酸的基因工程菌(PpDED和Pp2D2E2D);使用来自甘蓝型油菜的种子特异表达启动子-napin启动子,将三角褐指藻的Δ6脱饱和酶基因、Δ6延长酶基因与Δ5脱饱和酶基因构建入植物表达载体pCAMBIA1303,每个基因都处于napin启动子的控制下,构建好的载体转化拟南芥和甘蓝型油菜,得到了产长链多不饱和脂肪酸转基因拟南芥,并初步得到转基因的甘蓝型油菜苗。具体结果如下: 1.转基因酵母的Southern杂交结果显示,Δ6脱饱和酶基因、Δ6延长酶基因与Δ5脱饱和酶基因已经整合入酵母的基因组,用pAO1×D6E6D5转化的酵母其基因组中整合有单拷贝的D6E6D5,而用pAO2×D6E6D55转化的酵母其基因组中整合有双拷贝的D6E6D5。 2.对诱导表达的PpDED和Pp2D2E2D进行半定量RT-PCR分析,结果表明Δ6脱饱和酶、Δ5脱饱和酶和Δ6延长酶基因在Pp2D2E2D中的表达量分别是在PpDED中的1.87、1.92、1.74倍,表明增加基因的拷贝数,可以显著提高mRNA的表达量。 3.GC-MS分析诱导表达的转基因酵母的脂肪酸,在PpDED中,GLA、DGLA、AA占总脂肪酸的含量分别为3.5%,1.4%,0.1%;SDA、ETA和EPA占总脂肪酸的含量分别为0.6%,0.1%,0.05%。在Pp2D2E2D中,GLA、DGLA、AA占总脂肪酸的含量分别为4.2%,2.4%,0.3%;SDA、ETA和EPA占总脂肪酸的含量分别为0.6%,0.2%,0.1%。Pp2D2E2D中AA和EPA占总脂肪酸的含量分别是PpDED中的三倍和两倍。 4.分析转入的基因在重组酵母的转化效率,A6脱饱和酶的转化效率在PpDED中分别为22.7%(ω6)和20.7%(ω3),而在Pp2D2E2D中则增加为33.9%(ω6)和33.3%(ω3)。Δ6延长酶的转化效率在PpDED中分别为28.6%(ω6)和14.3%(ω3),在Pp2D2E2D中则增加为36.4%(ω6)和25%(ω3)。Δ5脱饱和酶的转化效率在ω3步骤中没有变化,均为33.3%,在ω6步骤中,转化效率则从6.7%提高到11.1%。。 5.得到了能够产长链多不饱和脂肪酸的转基因拟南芥,Southern杂交结果显示Δ6脱饱和酶、Δ5脱饱和酶和Δ6延长酶基因已整合入拟南芥基因组。转入的外源基因都只在种子中表达。转基因拟南芥种子中GLA,DGLA,AA的含量分别为6.2%、1.6%、0.5%,SDA,ETA,EPA的含量分别为0.9%、0.5%、0.05%。 6.通过潮霉素筛选,筛选到抗潮霉素的转基因甘蓝型油菜苗。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q78

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 刘建民;高山被孢霉多不饱和脂肪酸合成相关基因克隆及转化甘蓝型油菜研究[D];华中科技大学;2010年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前9条
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【共引文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张芹;长链不饱和脂肪酸链延长酶与去饱和酶进化分析及phytophthora infestans中相关基因鉴定[D];山东农业大学;2010年
2 杨悦;桑树内生真菌菜豆壳球孢菌MOD-1产油脂发酵条件优化及利用淀粉厂废水的研究[D];山东农业大学;2010年
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8 陈晓峰;脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶在酿酒酵母中共表达[D];福建师范大学;2010年
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10 沈国辉;DHA微胶囊稳定性及在婴幼儿奶粉中的应用研究[D];湖南农业大学;2010年
【同被引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 刘建民;高山被孢霉△6脂肪酸脱饱和酶基因的克隆及表达分析[D];华中科技大学;2007年
【二级引证文献】
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1 卢美欢;李利军;马英辉;王银存;王小娟;;终极腐霉多不饱和脂肪酸代谢分析[J];生物技术;2012年04期
【二级参考文献】
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5 本报记者 周欣;认清反式脂肪酸[N];中国医药报;2005年
6 白冰;老人要多吃炖烂的肥肉[N];中国中医药报;2007年
7 本报记者 李禾;ω-3脂肪酸对人体有哪些好处?[N];科技日报;2006年
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9 范建;我国首例富含ω—3转基因克隆猪降生[N];科技日报;2008年
10 周颖;减肥不等于不能吃油[N];光明日报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
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9 黄镇;分子标记辅助选择培育新型甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系[D];华中农业大学;2009年
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4 杨成军;甘蓝型油菜CHSA、CHSB基因以及WRKY44同源基因片断的克隆与序列分析[D];西南农业大学;2004年
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8 廖问陶;诸葛菜(Orychophragmus violaceus)及甘蓝型油菜(Brassica napus)Toc33基因编码区的克隆与分析[D];四川大学;2003年
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10 陈丽;多拷贝毕赤酵母重组菌表达PIP生理特性和动力学研究[D];华东理工大学;2011年
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