收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

LPS诱导uPA启动子的分子机制的研究

刘燕  
【摘要】: 第一部分大鼠uPA基因调控区域的构建及活性分析 实验一大鼠睾丸组织uPA基因启动子区的克隆与分析 目的:克隆大鼠睾丸组织uPA基因的启动子区并对该序列进行分析。 方法:从大鼠睾丸组织中提取基因组DNA,以其为模板设计uPA基因的引物,运用降落PCR法扩增uPA基因5’端上游的真核转录调控序列。将得到的PCR产物克隆测序,测序结果用启动子区的分析软件进行分析,并与其DNA序列进行比对。 结果:得到的uPA基因长度为1517 bp(ID:25916),经软件分析:该序列包含uPA基因完整的开放阅读框(ORF)、21bp长的外显子部分,1496bp长区域为转录起始的上游部分即是真核转录的调控区域。在其5’端UTR区的-30 bp的位置有一个不典型的TATA盒,其上游有非常明显的GC盒及启动子区常见的AP-1(Active protein 1)、SP1等结合位点。 结论:本文已成功克隆大鼠睾丸组织uPA基因启动子区。分析表明,该片段包含真核转录调控区域、一个不太明显的TATA盒、非常典型的GC盒及启动子区所常见的AP1、SP1等结合区域。 实验二大鼠睾丸组织uPA基因核心启动子的验证 目的:分析uPA基因启动子的结构和活性,明确调控uPA基因转录的启动子片段,探讨uPA的表达调控机制,研究uPA基因5’非编码区(NCR)在支持细胞内对uPA翻译启动功能的作用。 方法:从大鼠的基因组DNA中分离到约1.6 kb 5’旁侧区(flanking region)片段的大鼠uPA蛋白基因组基因序列,进而分析大鼠uPA 5’旁侧区片段中包含的启动子长度、结构、转录起始位点调节因子框架,以此设计5对引物,以大鼠基因组DNA为模板,梯度PCR分段扩增获取大鼠uPA基因5’旁侧区不同长度片段,经纯化、测序鉴定。将大鼠uPA5’旁侧区不同长度片段分别插入到没有启动子的PGL_3-Enhancer质粒中荧光素酶报告基因上游,构建质粒经菌落PCR、双酶切鉴定。将重组载体转染支持细胞(Sertoli cell)细胞24h后,Lumat弱光仪检测细胞裂解产物中荧火虫荧光素酶的表达活性以比较各片段的启动活性,确定uPA基因5’旁侧区的核心启动活性区。 结果:P1-167/+40(21 1bp)、P2-455/+40(499bp)、P3-758/+40(802bp)、P4-1 156/+40(1220bp)、P5-1544/+40(1588bp)这5个启动子片段具有转录活性,而-455/+40启动子片段的转录活性最强,-167/+40、-1546/+40转录活性其次,-758/+40、-1156/+40这2个启动子片段转录活性很弱。 结论:近uPA基因转录起始点上游1600 bp的序列为大鼠uPA基因启动激活所必需,其中-465/+40序列区为uPA基因启动子的核心部分。-167/-455、-1156/-1544之间存在调控性启动子或增强子等其它一些顺式元件,-455/-758、-758/-1156之间存在转录负性调控因子。获得了含核心启动子活性序列-455/+40的荧光素酶报告基因重组载体,有望以此序列发现与专一调控uPA基因转录相关的特异DNA结合蛋白。为进一步阐明uPA基因转录调控机制、探讨uPA对生精过程调节奠定基础。 第二部分LPS在大鼠支持细胞中对uPA基因转录核心活性区域的作用 实验一LPS对uPA基因转录活性区域的影响 目的:观察LPS对uPA基因转录调控区域的诱导作用,探讨uPA转录的具体调控机制。 方法:以PGL_3-Control载体为对照,与验证明确的重组载体PGL3-uPA-499bp分别转染到支持细胞后,LPS分别进行诱导,诱导时间分别为0、12、24、48h。诱导后用双荧光素酶系统进行比较,Lumat弱光仪检测诱导前后荧光素酶活性变化,同时观察二组间荧光素酶活性差别。 结果:PGL_3-Control载体对照组在LPS诱导下0、12、24、48h荧光素酶活性差别不大,重组载体PGL3-uPA-499bp在LPS诱导下0、12、24、48h荧光素酶活性有差别,以24h作用显著。PGL_3-Control载体对照组与重组载体PGL3-uPA-499bp比较其荧光素酶活性变化较大。 结论:双荧光素酶检测结果表明LPS对uPA基因核心转录调控区域有上调作用,能够调节启动活性。PGL_3-Control的CMV启动子在LPS刺激后没有明显差异,uPA基因核心转录区域在刺激后有明显差异,但是LPS对uPA基因核心转录调控区域的上调作用并不随着刺激时间的增加而增加,有转录活性增加的强度观察在一定量LPS刺激下12h活性最强。在一定量LPS刺激下没有时间依耐性,由此说明uPA基因转录活性的增加不具有时间依耐性。 实验二LPS刺激大鼠支持细胞uPA的变化 目的:LPS对uPA基因转录调控区域有上调作用,进一步观察LPS刺激下uPA在支持细胞的表达。 方法:免疫细胞化学(IHC)方法观察LPS刺激支持细胞0、12、24、48h后与空白对照组比较uPA蛋白的分泌情况,统计学方法分析uPA蛋白表达强弱。 结果:免疫细胞化学结果表明LPS刺激下uPA在支持细胞胞浆分泌增加,以刺激12h较显著。 结论:这一结果与前期研究LPS刺激uPA基因转录调控区域上调具有一致性。由此可以说明LPS刺激uPA分泌增加是通过基因转录水平调控机制发挥作用,转录活性上调导致表达水平增加。 第三部分大鼠uPA基因I FN刺激应答机制在生殖系统的研究 实验一LPS刺激信号转导途径中细胞因子IL-1、IL-6的变化 目的:LPS刺激支持细胞胞浆uPA分泌量增加,但是相关性细胞因子IL-1、IL-6转录水平的变化情况还不清楚,目前已有研究表明LPS刺激下细胞上清液中IL-1、IL-6分泌量会有增加,不具有LPS剂量及时间依从性,但是目前的研究只局限在LPS变化下支持细胞分泌IL-1、IL-6的变化。进一步研究LPS-TLR4信号转导通路IL-1、IL-6所发挥的作用及信号通路中细胞因子的相关性。 方法:用LPS与anti-IRF3干扰支持细胞0、12、24、48h用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)方法检测IL-1、IL-6转录水平mRNA变化情况,以单因素LPS及anti-IRF3做对比检测分析IL-1、IL-6转录水平mRNA变化情况后统计学分析检测结果。 结果: (1) LPS刺激组IL-1、IL-6 mRNA表达量较LPS+anti-IRF3组IL-1、IL-6 mRNA表达量多,差异具有统计学意义(P<0.05)。 (2)anti-IRF3组与空白对照组比较发现IL-1、IL-6的mRNA表达水平没有差异,此两组分别与LPS组比较其IL-1、IL-6的mRNA表达水平明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。 (3) anti-IRF3组、空白对照组与LPS+anti-IRF3组比较其IL-1、IL-6的mRNA表达水平减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。 (4)各组在0、12、24、48h检测IL-1、IL-6mRNA水平没有LPS刺激时间依耐性。 结论:IL-1、IL-6是LPS诱导MyD88非依赖途径信号转导通路中的关键细胞因子。在LPS刺激下用anti-IRF3拮抗IRF3作用,IL-1、IL-6mRNA表达水平降低,表明anti-IRF3拮抗IRF3后支持细胞对LPS具有明显的抗性。在没有LPS刺激下只用一种因素anti-IRF3拮抗IRF3结果表明IL-1、IL-6mRNA表达水平没有变化,说明必需要有外源刺激因素的存在才能诱导IRF3转入核内发挥作用,支持细胞发挥免疫防御反应与细胞因子IL-1、IL-6密不可分。各组在0、12、24、48h检测IL-1、IL-6mRNA水平发现在一定量LPS刺激下没有时间依耐性,推断LPS刺激支持细胞发挥免疫防御作用可能主要是通过启动MyD88非依赖途径信号转导通路起作用,为下一步具体分析支持细胞LPS-TRL4信号转导通路的信号分子提供基础。 实验二LPS刺激uPA转录区域在信号转导途径中的作用 目的:本实验为了研究uPA基因是否主要是在MyD88非依赖性的NF-κB/IRFs信号转导通路中起作用,用LPS、anti-IRF3、IFN-β三个刺激因子分别在0、12、24、48h干扰支持细胞观察uPAmRNA及蛋白表达变化的情况,为进一步了解uPA基因在此信号转导通路中分子作用机制提供理论依据。了解基因启动子区重要的顺式调控元件和相关的反式作用因子以及核基因对于诱导信号的应答机制,明确调控uPA基因表达的靶标。 方法:分别用空白对照、LPS、anti-IRF3、LPS+anti-IRF3、LPS+IFN-β、IFN-β6组对分泌uPA蛋白的支持细胞进行体外诱导,诱导作用时间分别为0、12、24、48h。诱导后以β-Actin为内参采用Real-time PCR与Western-blot方法检测uPAmRNA和蛋白水平。 结果: (1)LPS+IFN-β组uPAmRNA表达水平较其它组都高,与LPS组比较没有统计学意义(P=0.347>0.05);LPS+IFN-β组uPAmRNA表达水平比IFN-β组多,差异具有统计学意义(P<0.001)。 (2)空白对照组uPAmRNA表达水平比LPS组、IFN-β组、LPS+IFN-β组、LPS+anti-IRF3组低,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05,P<0.001,P=0.0028<0.01)。 (3)LPS+anti-IRF3组uPAmRNA表达水平比anti-IRF3组高,差异具有统计学意义(P=0.001<0.01);LPS+anti-IRF3组uPAmRNA表达水平比LPS组低,差异具有统计学意义(P<0.05)。 (4)空白对照组uPAmRNA表达水平与anti-IRF3组比较没有统计学意义(P=0.77>0.05);LPS+anti-IRF3组uPAmRNA水平比LPS+IFN-β组低,差异具有统计学意义(P<0.001)。 (5)IFN-β组uPAmRNA表达水平比LPS+anti-IRF3组高,差异具有统计学意义(P=0.014<0.05);IFN-β组比anti-IRF3组uPAmRNA水平高,差异具有统计学意义(P<0.01)。 (6)IFN-β组与LPS+anti-IRF3组uPA蛋白表达量没有统计学意义(P>0.05)。 (7)LPS组刺激12h uPA蛋白表达量比24、48h多这与前期免疫细胞化学结果一致。LPS刺激组uPAmRNA表达水平12h与24h、12h与48h比较没有统计学意义。 (8)在0、12、24、48h观察各组uPA的表达变化发现uPAmRNA与蛋白表达不具有时间依耐性。 结论:在支持细胞中LPS与IFN-β诱导LPS-TRL4信号发生有协同作用。IFN-β诱导uPA表达量的增加,表明uPA可能在LPS-TRL4MyD88非依赖性的NF-κB/IRFs信号转导通路刺激细胞因子分泌途径中发挥作用。在LPS刺激下用anti-IRF3拮抗IRF3作用,uPAmRNA与蛋白水平降低,表明anti-IRF3拮抗IRF3后支持细胞对LPS具有抗性。LPS-TRL4信号转导途径中uPA发挥作用,其可能是由于在LPS刺激下uPA表达量增加而促进细胞外基质迁移作用发挥支持细胞的防御机制。大鼠支持细胞分泌细胞因子促进uPA蛋白的表达,在uPA基因转录区域有专一调控uPA基因特异DNA的结合位点,明确了调控uPA基因表达的靶标。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 ;华中科技大学学报医学版稿约[J];华中科技大学学报(医学版);2011年04期
2 高明;吴南翔;宋杨;金凌之;楼建林;陶核;;原代培养大鼠睾丸支持细胞PCB153暴露后超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的时间变化特征[J];环境与健康杂志;2011年05期
3 毛胜艳;廖晓岗;姜蓉;刘燕;姚志勇;;黄芪甲苷对镉致大鼠支持细胞损伤的保护作用[J];激光杂志;2011年04期
4 ;2011年华中科技大学同济医学院药学院建院40周年院庆暨“药物研究与应用2011高峰论坛”征文通知[J];医药导报;2011年07期
5 ;华中科技大学同济医学院药学院建院40周年院庆暨药物研究与应用2011年高峰论坛征文通知[J];医药导报;2011年08期
6 廖晓岗;石之虎;邹聪;毛胜艳;范京川;;镉对大鼠睾丸支持细胞波形蛋白、E-钙黏蛋白表达及血睾屏障的影响[J];重庆医科大学学报;2011年07期
7 ;华中科技大学基础医学实验教学中心[J];中国现代教育装备;2011年13期
8 安健;张鹏;;形神兼备 建设国内一流实验教学中心——专访华中科技大学基础医学实验教学中心主任李和教授[J];中国现代教育装备;2011年13期
9 ;书讯[J];放射学实践;2011年08期
10 ;欢迎订阅2011年《中西医结合研究》杂志[J];中西医结合研究;2011年04期
11 ;《临床心血管病杂志》稿约[J];临床心血管病杂志;2011年07期
12 ;欢迎订阅2011年《中西医结合研究》杂志[J];中西医结合研究;2011年03期
13 ;欢迎订阅《中国社会医学杂志》[J];中国社会医学杂志;2011年04期
14 ;欢迎订阅2012年《临床血液学杂志》[J];临床血液学杂志(输血与检验版);2011年04期
15 ;《中国中西医结合杂志》2011年征订启事[J];中国中西医结合消化杂志;2011年04期
16 李翠英;袁长巍;曹兴午;;抑制素与男性生殖功能[J];中国男科学杂志;2010年08期
17 ;欢迎投稿、订阅2011年《现代泌尿生殖肿瘤杂志》[J];现代泌尿生殖肿瘤杂志;2011年03期
18 ;特邀策划顾问 金新政教授[J];中国卫生质量管理;2011年03期
19 马合苏提;蒲春林;靳宏勇;王英刚;闵立贵;张培新;张建军;唐泽天;阿布都热合曼;南玉奎;;新疆210例无精子症患者睾丸针吸细胞学检查及病因分析[J];新疆医学;2011年05期
20 ;《神经损伤与功能重建》杂志征稿启事[J];骨科;2011年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王晓燕;李政;田永红;黄东晖;熊承良;;T及E_2对离体培养支持细胞tPA分泌的调节[A];中南六省性学会第一次学术年会暨湖北省性学会第二届第一次学术年会论文集[C];2003年
2 叶世隽;陈咏梅;;支持细胞中微丝对精子发生调控的研究[A];中国动物学会全国显微与亚显微形态科学(细胞及分子显微技术科学)分会第十一次学术研讨会论文摘要集[C];2002年
3 胡伟;李冬梅;韩晓冬;刘红玲;于红霞;;6种羟基化多溴联苯醚对大鼠睾丸支持细胞毒性的研究[A];持久性有机污染物论坛2008暨第三届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集[C];2008年
4 王晓燕;李政;田永红;黄东晖;熊承良;;T及E_2对离体培养支持细胞tPA分泌的调节[A];中华医学会第五届全国计划生育学术会议资料汇编[C];2004年
5 陈小玉;;睾丸支持细胞功能研究进展[A];中国环境诱变剂学会致癌专业委员会09年学术会议论文汇编[C];2009年
6 骆清铭;;华中科技大学生物医学光子学研究进展[A];第八届全国激光生物学学术会议暨《激光生物学》创刊十周年庆祝会会议指南及论文摘要[C];2002年
7 周宜男;林坚;王月珠;李庭芳;;卵巢的管状腺瘤和环行管状性索瘤(附二例光镜,电镜和临床观察)[A];第六次全国电子显微学会议论文摘要集[C];1990年
8 ;前言[A];第九届全国冷冻干燥学术交流会论文集[C];2008年
9 郭筠秋;许少华;曹博;;大鼠睾丸支持细胞在胎脑细胞培养中的作用[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
10 ;华中科技大学同济医学院附属梨园医院简介[A];第二届全国老年医药学学术会议论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘燕;LPS诱导uPA启动子的分子机制的研究[D];华中科技大学;2009年
2 李洁;雄性小鼠睾丸支持细胞中Attractin的功能研究[D];华中科技大学;2009年
3 田永红;三链形成寡核苷酸对大鼠Sertoli细胞尿激酶型纤溶酶原激活因子的反基因研究[D];华中科技大学;2007年
4 宋杨;P,p'-DDE诱导ROS在线粒体和MAPK信号转导通路中的作用[D];华中科技大学;2009年
5 刘俊;大鼠内耳感觉上皮细胞原代培养体系及椭圆囊感觉上皮细胞永生化细胞系的建立与毛细胞再生[D];华中科技大学;2006年
6 杨井;黑素瘤中过度表达c-FLIP异常激活β-catenin/TCF路径的研究[D];华中科技大学;2009年
7 刘叶;建立创业型大学:管理上转型的路径[D];华中科技大学;2010年
8 喻钧;慢病毒转染TLR_3基因的小分子RNA对人肺腺癌A549细胞增殖及免疫逃逸影响的研究[D];华中科技大学;2009年
9 陈凤花;BMI-1在肿瘤发生中的机制研究[D];华中科技大学;2006年
10 梁袁昕;神经营养因子-3基因修饰的神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[D];华中科技大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 叶海青;胰腺间充质干细胞对坏死胰腺组织修复作用的研究[D];吉林大学;2007年
2 杨蓓;支持细胞诱导骨髓干细胞向精原细胞分化的研究[D];南昌大学;2007年
3 熊涛;支持细胞对体外培养精原干细胞的作用途径研究[D];重庆医科大学;2011年
4 檀大羡;生精细胞体外培养的研究[D];广西医科大学;2004年
5 邹海军;成年公兔生精细胞和支持细胞的纯化及体外培养[D];扬州大学;2007年
6 覃兆鲜;水牛生精上皮细胞体外培养的初步研究[D];广西大学;2008年
7 张波;超声靶向微泡破坏对支持细胞的生物学效应研究[D];重庆医科大学;2010年
8 谢加书;华中科技大学基于导师负责制下研究生思想政治工作研究[D];华中科技大学;2004年
9 张峰;社会资本与教师科研发展[D];华中科技大学;2005年
10 邱云良;环境内分泌干扰物对—壬基酚(p-NP)对大鼠睾丸支持细胞功能的影响及其机制探讨[D];四川大学;2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 韩晓玲;路钢任华中科技大学党委书记[N];湖北日报;2008年
2 记者 魏劲松 通讯员 范葳;华中科技大学与三一集团联合搭建产学研平台[N];经济日报;2009年
3 通讯员周小斌;华中科技大学、石河子大学牵手四年 石大受益多多[N];石河子日报(汉);2010年
4 记者 方政军 徐海波;华中科大建成电子决策剧场,助科学决策[N];新华每日电讯;2010年
5 记者曾革楠;华中科技大学出版社2010年销售收入过亿元[N];中国新闻出版报;2010年
6 记者 叶桂华;我市与华中科技大学开展全面科技合作[N];泰州日报;2011年
7 田国强,美国德州A&M大学终身教授,上海财经大学经济学院院长。;理解华中科技大学“经济学家现象”[N];中国社会科学报;2010年
8 通讯员 董宣 记者 刘志伟;华中科技大学企业科技特派员驰援大冶[N];科技日报;2009年
9 记者 王晓晴;华中科大深圳产学研基地奠基[N];深圳特区报;2009年
10 记者 廖君;华中科技大学解除肖传国职务[N];新华每日电讯;2010年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978