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《华中科技大学》 2009年
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TRPC6在足细胞损伤中的作用研究

孙希锋  
【摘要】: 第一部分 足细胞损伤时TRPC6表达的变化及TRPC6高表达对裂孔隔膜蛋白及细胞骨架的影响 目的:观察PAN作用下体外培养的小鼠足细胞TRPC6分布以及表达的变化,进一步研究TRPC6高表达对足细胞裂孔隔膜分子Nephrin及细胞骨架成分α-actinin-4和α-tubulin的影响。 方法:在33℃许可条件下培养的小鼠足细胞传代后转入37℃非许可条件下继续培养14天,以不同浓度(10μg/ml,30μg/ml,50μg/ml,70μg/ml)、不同时间(6小时,12小时,24小时,48小时)PAN处理足细胞,分别应用免疫荧光技术观察TRPC6分布的变化;用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chainreaction,RT-PCR)及Western印迹方法分别检测TRPC6 mRNA及蛋白水平的变化。用脂质体法将小鼠TRPC6真核表达载体pEGFP-N_1-mTRPC6转染足细胞,48小时后用荧光显微镜观察EGFP的表达;48小时后Western印迹方法检测转染后TRPC6蛋白表达的变化;应用免疫荧光技术观察转染后Nephrin、α-actinin-4、α-tubulin分布的变化;用RT-PCR及Western印迹方法分别检测Nephrin、α-actinin-4、α-tubulin mRNA及蛋白水平的变化。 结果:成熟足细胞TRPC6主要分布于细胞核周围和细胞膜,PAN作用24小时后足细胞上TRPC6分布出现变化,细胞膜上分布明显增强,48小时后变化更加明显。PAN作用于足细胞后,TRPC6 mRNA及蛋白表达水平明显升高,并呈现剂量依赖性和时间依赖性,在30μg/ml PAN作用下,TRPC6的表达即明显升高(P<0.05),当更高浓度PAN作用时,TRPC6的增高更加明显(P<0.01);应用50μg/ml PAN时,在12小时TRPC6 mRNA及蛋白表达开始上调(P<0.05)并随作用时间的延长逐渐增高。pEGFP-N_1-mTRPC6转染足细胞后约35%细胞出现绿色荧光;足细胞TRPC6蛋白表达水平明显增高(P<0.01)。转染TRPC6以后Nephrin、α-actinin-4分布均出现变化;Nephrin在mRNA及蛋白水平分别下降42%及26%左右(P<0.05);α-actinin-4在mRNA及蛋白水平分别下降22%及25%左右(P<0.05);TRPC6高表达对α-tubulinmRNA及蛋白水平无影响,但可影响其分布。 结论:在PAN作用于足细胞导致其损伤后,TRPC6分布出现变化并且其表达增高;TRPC6高表达干扰了足细胞裂孔隔膜分子Nephrin以及细胞骨架蛋白α-actinin-4、α-tubulin的正常定位及功能。 第二部分 TRPC6在AngⅡ诱导的小鼠足细胞凋亡过程中的作用 目的:研究TRPC6高表达对AngⅡ诱导的小鼠足细胞凋亡的影响并初步探讨其作用机制。 方法:在33℃许可条件下培养的小鼠足细胞传代后转入37℃非许可条件下继续培养14天,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测不同浓度AngⅡ对足细胞活性的影响;用脂质体法将针对小鼠TRPC6的基因真核表达载体pEGFP-N_1-mTRPC6转染体外培养的永生化小鼠足细胞系,同时转染pEGFP-N_1空载体作为对照,48小时后用倒置荧光显微镜观察EGFP的表达,Western印迹方法检测转染后TRPC6蛋白表达的变化;应用AngⅡ(10~(-6)mol/L)处理足细胞,Fluo-3AM结合激光共聚焦显微镜观察转染TRPC6基因后足细胞胞浆内钙离子浓度的变化;将细胞分组,分别采用低剂量(10~(-10)mol/L)及高剂量(10~(-6)mol/L)AngⅡ刺激细胞,24小时后用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)及Western印迹方法分别检测Bax、Bcl-2mRNA及蛋白水平的变化;流式细胞仪及Hoechst33258染色法检测足细胞凋亡。 结果:低剂量AngⅡ(10~(-10)mol/L)作用24小时,对足细胞活力无影响;高剂量AngⅡ(10~(-6)mol/L)作用24小时后足细胞活力下降约50%;pEGFP-N_1-mTRPC6转染足细胞后约35%细胞出现绿色荧光,足细胞TRPC6蛋白表达水平明显增高(P<0.01);转染TRPC6以后可以明显促进AngⅡ诱导的足细胞钙离子内流(P<0.01);低剂量AngⅡ(10~(-10)mol/L)作用24小时后,与对照组相比,Bax、Bcl-2mRNA及蛋白的表达无明显变化;转入TRPC6基因后,Bax mRNA及蛋白表达水平明显增高(P<0.01)而Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平明显下调(P<0.05);高剂量AngⅡ(10~(-6)mol/L)作用24小时可上调Bax的表达而下调Bcl-2的表达(P<0.01),转染TRPC6基因则Bax的表达进一步升高而Bcl-2的表达进一步下降(P<0.01,P<0.05);在低剂量AngⅡ(10~(-10)mol/L)作用下,足细胞凋亡率为(2.50±0.72)%,转染TRPC6以后凋亡率为(4.33±0.45)%(P<0.05);在高剂量AngⅡ(10~(-6)mol/L)作用下,足细胞凋亡率为(15.46±1.40)%,转染TRPC6以后凋亡率为(18.33±0.87)%(P<0.01),转染pEGFP-N_1空载体对凋亡率则无影响。 结论:TRPC6在AngⅡ诱导的足细胞凋亡中发挥重要作用;TRPC6可能通过增加钙离子内流,进而启动其下游的凋亡调节成分参与凋亡过程。 第三部分 TRPC6 shRNA真核表达质粒的构建及其对足细胞损伤的影响 目的:构建针对TRPC6基因的短发夹结构RNA(shRNA)真核表达质粒,观察基因敲低TRPC6对PAN诱导的小鼠足细胞损伤的影响。 方法:设计两条针对TRPC6mRNA不同靶序列的干扰序列,将其插入真核表达质粒pGCsi-U6-Neo-GFP-shRNA,构建针对TRPC6基因的shRNA表达载体pGCsi-TRPC6A和pGCsi-TRPC6B,经酶切和DNA测序证实;选择不与任何基因同源的序列NC作为阴性对照;用脂质体法将构建成功的3种重组质粒转染体外培养的永生化小鼠足细胞系。24及48小时后用荧光显微镜观察GFP的表达;48小时后RT-PCR法和Western印迹法检测TRPC6的干扰效率。将细胞分为4组:正常对照组、PAN干预组、PAN干预+转染pGCsi-TRPC6B组以及PAN干预+转染pGCsi-NC组。PAN作用48小时后应用Western印迹法检测Nephrin、CD2AP表达的变化,应用RT-PCR及Western印迹法分别在mRNA及蛋白水平检测Bax、Bcl-2表达的变化;应用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。 结果:应用质粒提取试剂盒抽提重组质粒pGCsi-TRPC6A及pGCsi-TRPC6B后进行测序分析,基因测序结果证明插入到pGCsi-U6-Neo-GFP-shRNA的序列与设计的序列完全一致,符合设计要求;小鼠足细胞转染shRNA24小时后,GFP的表达率为45%左右;pGCsi-TRPC6A及pGCsi-TRPC6B均下调了TRPC6 mRNA及蛋白的表达(P<0.05),但pGCsi-TRPC6B作用较pGCsi-TRPC6A更强,因此后续实验采用pGCsi-TRPC6B;PAN作用48小时后Nephrin及CD2AP表达明显下调,PAN干预+转染pGCsi-TRPC6B组Nephrin及CD2AP下降不明显(P<0.05),PAN作用48小时后在mRNA及蛋白水平均上调了Bax的表达而下调了Bcl-2的表达;转染TRPC6shRNA质粒后可明显逆转上述改变(P<0.05);基因敲低TRPC6可以明显降低PAN诱导的足细胞凋亡率(P<0.05)。 结论:成功构建了针对TRPC6基因的shRNA真核表达质粒,转染足细胞后能发挥确切的RNA干扰作用使TRPC6基因沉默;基因敲低TRPC6能有效保护PAN诱导的足细胞损伤。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R692

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【参考文献】
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