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Ghrelin对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的抑制作用及其机制研究

万晶晶  
【摘要】: 第一部分Ghrelin对巨噬细胞源性泡沫细胞ATP结合盒转运子A1和G1表达的调控作用 背景:ATP结合盒转运子A1和G1(ATP-binding cassette transporter A1/G1,ABCA1/ABCG1)是两种胞膜蛋白。在动脉壁,ABCA1是单核巨噬细胞内胆固醇流出的重要途径,其基因突变可引起胞内胆固醇流出障碍;ABCG1也是单核巨噬细胞内胆固醇流出的途径之一,有助于清除脂质,防止泡沫细胞形成,从而抑制动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的形成。Ghrelin是一种促生长激素释放肽,与糖脂代谢及相关疾病有密切联系,诸多研究提示Ghrelin在AS的发展中扮演着有益的角色,但Ghrelin对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的调控作用及机制尚未见报道。 目的:本研究探讨了Ghrelin对单核/巨噬细胞泡沫化过程中胞内脂滴含量的影响,同时研究单核/巨噬细胞分化成为泡沫细胞过程中Ghrelin对ABCA1和ABCG1表达的调控作用,以揭示其抗AS的效应及其机制。 方法:体外培养人源单核细胞系THP-1,由佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)作用使其分化为巨噬细胞,后者可在在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)存在条件下进一步转变为泡沫细胞,油红O染色法鉴定泡沫细胞形成。巨噬细胞加入不同浓度的Ghrelin(10~(-7)mol/L,10~(-6) mol/L,10~(-5)mol/L)预孵2小时后再加入ox-LDL共同孵育不同时间(12h,24h,48h),随后各组均加入10mg/L的apoA-I,CO_2培养箱中孵育12小时。油红O染色法观察细胞内脂滴含量,运用PT-PCR法检测ABCA1和ABCG1mRNA水平,Western-blot法检测ABCA1和ABCG1蛋白表达,采用酶法,通过荧光分光光度计检测细胞内外胆固醇含量并计算胆固醇流出率。 结果:Ghrelin可明显减少细胞内脂滴的形成,显著增加胞内游离胆固醇流出率,随着Ghrelin浓度增高,其抑制胞内胆固醇酯含量和增加胆固醇流出率的作用增强,10~(-7)mol/L,10~(-6)mol/L和10~(-5)mol/L Ghrelin干预组胆固醇流出率分别为(29.3±1.1)%,(36.0±1.4)%和(41.6±2.1)%,差异具有统计学意义(P<0.05);胆固醇酯含量分别为34.5±3.0、27.8±2.3、24.3±2.3,与泡沫细胞组相比有显著差异(P<0.05)。但不同作用时间组无明显差别。Ghrelin能显著增加单核/巨噬细胞泡沫化过程中ABCA1和ABCG1 mRNA水平和蛋白表达,不同浓度干预组ABCA1/G1表达有显著差异(P<0.05),不同时间组ABCA1/G1表达无统计学差异(P>0.05)。 结论:Ghrelin能上调ABCA1和ABCG1 mRNA与蛋白的表达,从而促进胞内胆固醇流出,抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,并可能因此而延缓动脉粥样硬化的发生;Ghrelin的上述作用呈浓度依赖性而不呈时间依赖性。 第二部分Ghrelin通过生长激素促分泌素受体抑制巨噬细胞源性泡沫细胞形成 背景:Ghrelin是生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor,GHS-R)的配体,能通过与该受体结合发挥促生长激素分泌的效应。巨噬细胞膜上也同样表达GHS-R,目前研究表明在动脉粥样硬化斑块处Ghrelin受体的密度明显上调。我们前面的研究提示Ghrelin能通过下调酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(acyl-CoA:cholesterol acyltransferases,ACAT1)的表达、上调ABCA1和ABCG1的表达而促进胆固醇外流,从而抑制胆固醇酯聚集于巨噬细胞使之泡沫化。据此,我们推测上述表象是Ghrelin通过与GHS-R发生受体-配体相互作用而发挥效应。 目的:以人单核细胞系THP-1源性泡沫细胞为研究对象,探讨不同程度拮抗GHS-R受体后,Ghrelin对单核巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中人ACAT-1和ABCA1/G1基因和蛋白表达的调控作用。检测不同程度拮抗GHS-R受体后,Ghrelin对单核巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响,其胞内胆固醇酯含量及胆固醇流出率变化。 方法:体外培养THP-1,由佛波酯(PMA)诱导分化为巨噬细胞,继而在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)存在条件下进一步转变为泡沫细胞,油红O染色法鉴定泡沫细胞形成。单核细胞分化为巨噬细胞后,与不同浓度(10~(-5)mol/L,5×10~(-5)mol/L,10~(-4)mol/L)GHS-R特异性拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6预孵2h后,再与Ghrelin(浓度为10~(-5)mol/L)共育,2h后加入ox-LDL作用24h。随后各组均加入10mg/L的apoA-I,CO_2培养箱中孵育12小时。运用PT-PCR法和Western-blot法分别检测Ghrelin干预后及拮抗生长激素促分泌素受体后ACAT-1、ABCA1和ABCG1 mRNA水平与ACAT-1蛋白表达,采用酶法,通过荧光分光光度计检测细胞内外胆固醇含量和游离胆固醇含量,并计算胆固醇酯含量和胆固醇流出率。 结果:油红O染色结果显示GHS-R拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6阻断Ghrelin对巨噬细胞泡沫化的抑制作用。Ghrelin能显著降低单核/巨噬细胞泡沫化过程中ACAT-1mRNA水平和蛋白表达(P<0.01),不同浓度(10~(-5)mol/L,5×10~(-5)mol/L和10~(-4)mol/L)[D-Lys3]-GHRP-6干预后,ACAT-1 mRNA水平逐渐增高,分别为1.14±0.04,1.58±0.03和2.4±0.16,ACAT-1蛋白表达也逐渐增高,分别为1.25±0.09,1.77±0.11和2.3±0.09,与Ghrelin组(mRNA:0.89±0.05,蛋白:0.86±0.08)相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,Ghrelin能显著增加单核/巨噬细胞泡沫化过程中ABCA1/G1 mRNA水平和蛋白表达(P<0.01)。拮抗GHS-R后,Ghrelin抑制泡沫细胞形成的效应被阻断,且GHS-R特异性拮抗剂浓度越高,该阻断作用越明显(P<0.05)。胆固醇含量检测结果表明,不同浓度[D-Lys3]-GHRP-6干预组较Ghrelin组胞内胆固醇酯含量分别升高了(16.7±1.2)%,(54.5±4.5)%和(73.4±7.9)%,阻断了Ghrelin抑制胆固醇酯形成的作用作用(P<0.05)。胆固醇流出率结果则表明,[D-Lys3]-GHRP-6也阻断了Ghrelin对胆固醇流出的促进作用(P<0.05)。 结论:Ghrelin可能通过GHS-R途径下调ACAT-1转录翻译水平,及上调ABCA1/G1转录翻译水平,从而抑制胆固醇聚集于巨噬细胞,并同时促进胞内胆固醇的流出,避免游离胆固醇滞留于细胞。若拮抗Ghrelin的受体GHS-R,则Ghrelin的这种有益的效应被阻断,而不能发挥抑制巨噬细胞泡沫化的作用。 第三部分过氧化物酶体增生物激活受体γ信号通路参与Ghrelin抑制巨噬细胞泡沫化过程 背景:过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)是PPAR超家族的亚型之一,属于核受体转录蛋白。PPARγ表达于巨噬细胞核内,并被证实能调节细胞和动脉壁脂质稳态,提示其在抗动脉粥样硬化中发挥着重要作用。我们早期研究显示PPARγ的活化能使ACAT1的表达受抑制。而我们前面的研究证实Ghrelin能下调ACAT1表达,因此,我们推测PPARγ信号通路参与了Ghrelin对ACAT1的调控过程。我们进一步推测PPARγ也同时参与了Ghrelin对ABCA1和ABCG1的调控作用。 目的:以人单核/巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,探讨Ghrelin对人单核细胞系(THP-1)源性泡沫细胞PPARγ表达的调控作用;探讨不同程度地抑制PPARγ后,胞内胆固醇酯含量及胆固醇流出率的变化;探讨不同程度抑制PPARγ对Ghrelin调控ACAT-1、ABCA1和ABCG1 mRNA与蛋白表达的影响,从而确定PPARγ信号通路是否为Ghrelin抑制巨噬细胞泡沫化的机制之一。 方法:体外培养THP-1,在佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)的诱导下分化为巨噬细胞,与不同浓度(10~(-7)mol/L,10~(-6)mol/L,10~(-5)mol/L)ghrelin预孵后加入氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共育24h。运用PT-PCR法和Western-blot法分别检测不同浓度Ghrelin(10~(-7)mol/L,10~(-6)mol/L,10~(-5)mol/L)作用后PPARγmRNA与蛋白的表达。巨噬细胞与不同剂量(10μmol/L,20μmol/L,50μmol/L)PPARγ特异性抑制剂GW9662预孵2h后,加入Ghrelin(10~(-5)mol/L)作用2h,再与终浓度为100mg/Lox-LDL共育24h,随后各组均加入10mg/L的apoA-I,CO_2培养箱中孵育12小时。油红O染色法观察细胞内脂滴含量;PT-PCR法和Western-blot法分别检测Ghrelin干预后PPARγmRNA与蛋白的表达,以及不同程度抑制PPARγ后ACAT-1、ABCA1和ABCG1mRNA水平与ACAT-1蛋白表达,采用酶-荧光分光光度计法检测细胞内外胆固醇含量和游离胆固醇含量,并计算胆固醇流出率。 结果:与泡沫细胞组相比,不同浓度组(10~(-7)mol/L,10~(-6)mol/L,10~(-5)mol/L)Ghrelin能显著增加单核/巨噬细胞泡沫化过程中PPARγmRNA与蛋白表达,且干预的Ghrelin浓度越高,PPARγ表达越高,其mRNA表达分别为0.87±0.06,1.44±0.15,1.57±0.11,其蛋白表达分别为0.82±0.06,1.46±0.11,1.73±0.14,与泡沫细胞组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。抑制PPARγ后,Ghrelin抑制泡沫细胞形成的效应被阻断,且PPARγ抑制剂浓度越高,该阻断作用越明显。PPARγ的抑制剂GW9662还拮抗了Ghrelin对巨噬细胞泡沫化过程中ACAT-1和ABCA1/G1 mRNA水平和蛋白表达的调控作用,随着PPARγ抑制剂剂量的增高,其阻断Ghrelin下调ACAT-1和上调ABCA1/G1的效应越显著(P<0.05)。胆固醇流出率结果显示,GW9662对照组和泡沫细胞组胞内胆固醇酯含量及胆固醇流出率无显著差别;不同剂量GW9662干预后,胞内胆固醇含量较Ghrelin组升高了(18.3±4.3)%,(30.6±11.4)%,(52.6±8.4)%;而胆固醇流出率则分别下降了(14.3±3.2)%,(27.3±4.1)%,(47.7±4.6)%,差异均有统计学意义。(P<0.05)。 结论:Ghrelin能浓度依赖性上调单核/巨噬细胞泡沫化过程中PPARγmRNA与蛋白表达,并进而调控PPARγ下游途径ACAT-1、ABCA1和ABCG1的转录和翻译水平,从而抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,并可能通过该信号转导通路发挥抗动脉粥样硬化的作用。


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