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肝细胞高胆固醇负荷活化未折叠蛋白应答介导细胞凋亡损伤的研究

李琦  
【摘要】: 资料显示肝细胞胆固醇聚积可导致细胞损伤,为了探讨胆固醇负荷时肝细胞损伤作用及可能机制,我们体外检测了在胆固醇负荷条件下肝细胞的凋亡发生,未折叠蛋白应答活化,以及它们间的相关性。采用200μg/ml LDL或者200μg/ml LDL联合20μg/ml胆固醇酯化酶ACAT抑制剂58035孵育人正常肝L02细胞24h;采用胆固醇氧化酶胆固醇酯酶法联合高效液相色谱(HPLC)法检测胞内总胆固醇(TC),游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的含量;RT-PCR分析UPR主要标志分子(BiP,XBP1,ATF6,ATF4,CHOP)基因mRNA表达水平;Western Blot检测BiP,ATF6表达及活化caspase-3蛋白片段的表达变化;Annexin V-FITC-PI荧光标记染色观察细胞凋亡;在LDL孵育的不同细胞组别中进一步添加3mM UPR抑制剂PBA,观察细胞凋亡及活性caspase-3的表达变化。结果发现,与对照组相比:用LDL孵育的细胞内胆固醇含量增加明显,对照组细胞FC含量为5.90±0.36μg/mg,LDL组中FC为11.17±0.35μg/mg,LDL+58035组为13.20±0.66μg/mg;LDL组中伴侣分子BiP mRNA和蛋白表达水平明显诱导上调,sXBP1和CHOP mRNA表达水平诱导增加,而LDL+58035组中它们的诱导表达增加更明显,同时还诱导上调ATF4,ATF6的表达;对照组中细胞凋亡率为1.1±0.6%,而LDL组中活化的caspase-3增加到4.8±0.21倍,细胞凋亡率上升到12.9±1.4%,LDL+58035组中活化的caspase-3增加到8.4±0.46倍,细胞凋亡率达到21.3±2.4%。进一步在LDL孵育的组别中添加UPR抑制剂PBA后分别检测细胞凋亡发生与活化caspase-3蛋白表达的变化,与对应的未加PBA的组别相比:LDL+PBA组和LDL+58035+PBA组中细胞凋亡率分别降至8.8±1.1%和14.9±1.6%,活化caspase-3蛋白表达减至对照组的2.5±0.13倍和5.7±0.35倍。以上结果表明胆固醇负荷能使L02肝细胞发生内质网应激,激活UPR,并引起细胞凋亡损伤,而活化的UPR介导了该凋亡损伤。


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