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《华中科技大学》 2009年
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乌头碱对大鼠心肌细胞毒性作用的分子毒理学机制研究

刘艳  
【摘要】: 1研究背景 有毒动植物中毒是具有中国特色法医毒理学的重要组成部分,也是我国法医毒理学研究的重点内容之一。乌头与乌头属植物是我国临床常用的重要中药,是药用有毒植物的典型代表,也为我国最早有记载的有毒植物,其主要毒性成分为乌头类生物碱,其中以含有双酯基化学结构的乌头碱毒性最强。乌头碱的主要毒性作用的靶器官,主要为心脏与神经系统。有大量研究表明,乌头碱的毒性成份,也是其药性成份,具有强心、镇痛、抗炎、抗肿瘤、降低血压、降低血管通透性等作用,广泛地被应用于临床治疗。由于乌头碱的毒性剧烈,其有效治疗剂量与中毒剂量或致死量极为接近,用药稍有不慎,如因炮制不当,或误服等,即可引起中毒甚至死亡。而利用乌头属植物及乌头碱自杀、投毒他杀的案件时有发生,可见乌头碱中毒在有毒动植物中毒中占有重要位置。 为了进一步提高乌头碱中毒的诊断、治疗,规范乌头属有毒中药在疾病中的使用,同时,也为乌头碱中毒的法医学鉴定提供相关的理论依据,对乌头碱中毒机制研究,特别是乌头碱对心肌细胞的毒性作用机制研究,成为了中药研究与应用、临床急救医学和法医毒理学研究的重点问题。 近年来,国内外对乌头碱心肌细胞毒性作用机制的研究,已进入到细胞质膜动态变化的分子作用机理水平。但大多仍局限于心肌细胞损伤及单个心肌细胞离子通道检测等方面,对毒物靶器官心室肌细胞群毒性作用的分子毒理学机制,特别是乌头碱对心肌细胞之间信息传递的影响机制、基因表达调控机制尚不明确。 2研究目的 2.1系统观察不同浓度乌头碱染毒后心肌细胞的毒理病理学变化,研究不同中毒剂量、中毒时间与病变间的效应关系,优化、规范乌头碱靶器官的细胞培养及分子毒理学研究的基础方法; 2.2研究乌头碱中毒与心肌细胞DNA损伤的关系,为从分子毒理学角度研究DNA损伤与乌头碱中毒机制的关系提供基础; 2.3研究乌头碱染毒对心肌细胞Ca~(2+)依赖性蛋白激酶Cα亚型(PKCα)的表达、PKCα磷酸化水平,以及PKCα磷酸化对Cx43磷酸化表达的影响,明确其内在级联效应关系,及参与乌头碱心肌细胞毒性作用分子机制的途径; 2.4研究乌头碱对心肌细胞内Ca~(2+)调控蛋白表达的影响,观察Ca~(2+)调控蛋白参与乌头碱心肌细胞毒性作用机制的方式; 2.5研究乌头碱中毒特征及法医学鉴定注意事项。 3研究方法 3.1新生大鼠心肌细胞原代培养及其方法优化研究 选择1~2d的SD新生大白鼠,雄雌不限,消毒后直接剪取心室肌,用胰蛋白酶等消化液消化,制作心肌细胞悬液;于37℃、5%CO_2培养箱,以差速贴壁法培养原代心肌细胞,优化心肌细胞原代培养方法,提高心室肌细胞纯度、成活率和心肌细胞群整体性。选用台盼蓝染色法进行培养心肌细胞活性鉴定;采用抗心肌特异性单克隆抗体,结合间接免疫荧光法检测,对心肌细胞纯度进行鉴定。规范、优化新生大鼠心肌细胞体外原代培养的方法,为后续研究建立良好地基础。 3.2乌头碱染毒模型的建立及毒性效应研究 于心肌细胞原代培养第6天,更换无血清培养液培养16~18h,以去除血清干扰,再加入不同浓度乌头碱,构建心肌细胞乌头碱染毒模型,根据实验目的不同,设定不同的阳性和阴性对照。实时动态监测乌头碱染毒心肌细胞的形态、功能的变化,研究乌头碱的毒性对心肌细胞损伤的量效作用。 3.3乌头碱对大鼠心肌培养细胞DNA损伤的研究 新生SD大鼠24只,随机分为6组;取心室肌以差速贴壁法原代培养心室肌细胞。培养第6天,更换无血清培养液培养后,制成密度为2×10~5个细胞/mL的细胞悬液,分别加入浓度为0.1、0.5、1.0、2.0μmol/L的乌头碱混合液,染毒30 min;并以PBS溶液作阴性对照。采用彗星电泳技术及CASP分析软件,检测不同浓度乌头碱染毒后心室肌细胞DNA损伤程度。实验重复6次。 3.4乌头碱对新生大鼠心肌培养细胞内PKCα表达的影响 取12孔原代心肌培养细胞组,分成对照组(Normal)、乌头碱染毒组(ACO)、碱性磷酸酶处理组(A.P.)、AAP干预组(AAP)、AAP干预后乌头碱染毒组(AAP+ACO)、PKCα抑制剂G(o|¨) 6976干预组(G(o|¨) 6976),及AAP与G(o|¨) 6976联合干预组(AAP+G(o|¨) 6976),共7组。提取各实验组及对照组心肌细胞总蛋白,以BCA法标准蛋白曲线定量,采用Western-blotting技术,选用P-Cx43(Ser-368)蛋白抗体、NP-Cx43(Ser-368)蛋白抗体、抗PKCα蛋白抗体,及P-PKCα(Ser-657)蛋白抗体,定量检测各组在培养心肌细胞内P-Cx43(Ser-368)蛋白、NP-Cx43(Ser-368)蛋白、总PKCα蛋白,及P-PKCα(Ser-657)蛋白表达含量变化。实验重复6次。 3.5乌头碱对心肌细胞PKCα及P-PKCα(Ser-657)位点磷酸化状态的影响 选择兔抗鼠总PKCα多克隆抗体(稀释度为1:200)、兔抗鼠磷酸化PKCα(Ser-657)(稀释度为1:200)功能性抗体,用Fluorescein标记山羊抗兔IgG和Rhodamine标记山羊抗兔IgG(稀释度为1:100),应用激光共聚焦扫描显微镜,结合细胞图像荧光定分析技术,检测乌头碱染毒前后,心肌细胞激酶Cα亚型及其第657位丝氨酸残基(Ser657)位点,特异性磷酸化状态的改变。 3.6乌头碱对大鼠心肌培养细胞Ca~(2+)调控蛋白表达的影响 取12孔原代心肌培养细胞组,运用荧光标记技术及RT-PCR技术,建立钠钙交换体(NCX)、肌浆网钙泵Ca~(2+)-ATP酶(SERCA_2)、磷酸受钠蛋白(PLB)、兰尼碱受体(RyR_2),及管家基因β-actin共5个基因座的多重荧光复合RT-PCR反应体系及扩增方法,在3100 DNA测序仪中进行毛细管电泳,检测乌头碱染毒组及正常对照组心肌细胞内NCX、SERCA_2、RyR_2、PLB四种基因mRNA表达的差异与变化。实验重复6次。 3.7乌头碱中毒10例法医学尸检资料分析 收集10例乌头碱中毒死亡的法医学鉴定资料,包括系统的法医学解剖资料及组织病理学检查结果,部分案例还有案情调查、抢救病历资料等;并按年龄、性别、中毒原因、中毒类型、病理变化及特征等分类整理。结乌头碱中毒的毒理病理组织学变化,探讨乌头碱中毒法医学鉴定的注意事项。 3.8实验数据的统计学分析 本实验研究采用SSPS统计软件(version 10.0,USA)分析,数据以(?)±s表示。 3.8.1彗星电泳结果采用CASP软件分析HDNA%、TDNA%、TL、TM、OTM,5个检测指标。计算各组平均值和标准差,以(?)±s表示,应用SSPS在方差齐性条件下做单因素方差分析,对各剂量组组间差异进行比较分析。 3.8.2正常对照组和各实验组中P-Cx43(Ser-368)蛋白表达和NP-Cx43(Ser-368)蛋白表达差异、总PKCα蛋白表达和P-PKCα(Ser-657)蛋白表达相对含量分析,应用SSPS做单变量两因素方差分析(ANOVA),对组间均数的多重比较选用Games-Howell检验。 3.8.3对ca~(2+)调控蛋白NCX、SERCA_2、RyR_2、PLB基因mRNA表达的差异与变化,应用SSPS做t检验。 4研究结果 4.1原代培养心肌细胞及其方法优化 在倒置相差显微镜下观察,刚接种时的心肌细胞悬浮于培养液中,为均一、分散的圆形折光颗粒;12 h后细胞已开始贴壁生长,偶尔可见个别细胞自发搏动;培养24 h后,贴壁细胞互相连接呈稀疏网状,并出现缓慢的同步化搏动;48 h后,心肌细胞在培养孔底部进一步伸展,呈现快速同步化搏动的细胞单层,搏动频率约80~120次/min;培养第6天,心肌细胞在培养孔底部充分伸展,形成稳定的同步化搏动细胞单层,频率约120次/min。采用台盼蓝染色法测定,活细胞的存活率平均达到97.33%;选用抗心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)特异性单克隆抗体,结合免疫荧光法检测,心肌培养细胞平均细胞纯度为97.1%。 4.2乌头碱对心肌培养细胞染毒模型的建立及毒性效应观察 建立乌头碱染毒模型,与正常对照组比较,不同剂量乌头碱染毒后,心肌细胞出现非同步性搏动,搏动减慢,甚至停博。心肌细胞乌头碱染毒后,毒理病理变化与中毒剂量、中毒时间呈现一定的相关性。 4.3乌头碱对大鼠心肌培养细胞DNA损伤的观察 心肌培养细胞被不同浓度乌头碱染毒后,尾部DNA含量、彗尾长度、尾矩、Olive-尾矩均随乌头碱浓度增加而升高,头部DNA含量则逐渐降低,与对照组相比,均有极显著性差异(P<0.01);结果显示,乌头碱染毒剂量越大,心肌细胞DNA损伤越严重。 4.4乌头碱对心肌培养细胞内PKCα蛋白表达的影响 4.4.1对心肌细胞内P-Cx43(Ser-368)表达的观察 各实验组均以Normal为参照。不同干预组对P-Cx43(Ser-368)蛋白表达均有所不同。与正常对照组比较,ACO、A.P.、G(o|¨) 6976组心肌细细胞P-Cx43(Ser-368)蛋白表达均下降;AAP、AAP+ACO、AAP+G(o|¨)9676组P-Cx43(Ser-368)蛋白表达均上升。选用Games-Howell统计方法,检验多组间均数的多重比较,显示ACO、A.P.、G(o|¨) 6976三组间,仅ACO染毒组具有统计学差异(P<0.05);而AAP、AAP+ACO、AAP+G(o|¨)9676三个干预组之间未见明显差异。从Western Blotting检测结果显示:ACO、A.P.、G(o|¨) 6976干预后,Cx43(Ser-368)位点磷酸化蛋白表达减少;经APP预处理后,磷酸化表达增强,且效果明显(P<0.01)。 4.4.2对心肌细胞内NP-Cx43(Ser-368)表达的观察 各组NP-Cx43(Ser-368)位点磷酸化状态蛋白定量分析结果显示:与正常对照比较,A.P.组、ACO染毒组、G(o|¨) 6976组表达增强(P<0.01),其中A.P.组表达最强。而AAP组、AAP+ACO组、AAP+G(o|¨) 6976联用组则表达降低(P<0.01)。 4.4.3对心肌细胞中总PKCα表达的观察 各组总PKCα蛋白定量分析结果显示:与正常对照比较,A.P.组、ACO染毒组、G(o|¨) 6976组、AAP组、AAP+ACO组、AAP+G(o|¨) 6976联用组心肌细胞内总PKCα表达水平无显著差异(P>0.05)。 4.4.4对心肌细胞中总P-PKCα(Ser-657)表达的观察 各实验组均以Normal为参照。不同实验干预组P-PKCα(Ser-657)蛋白均有不同程度的表达。正常组和ACO组心肌细胞内均有P-PKCα(Ser-657)蛋白表达,而A.P.组心肌细胞内无P-PKCα(Ser-657)蛋白表达。 与正常对照组相比较,ACO组、G(o|¨) 6976组心肌细胞中P—PKCα(Ser-657)磷酸化蛋白表达显著降低(P<0.01)。而AAP组、AAP+ACO组、AAP+G(o|¨) 6976联合处理组,磷酸化表达增强,心肌细胞P-PKCα(Ser-657)蛋白表达显著增高(P<0.01)。 4.4.5乌头碱染毒前后心肌细胞PKCα及PKCα(Ser-657)位点磷酸化状态的观察应用激光扫描共聚焦显微镜,观察免疫荧光检测结果显示: 标记总PKCα的Fluorescein呈绿色荧光信号,弥散性分布于心肌细胞胞浆中。与正常对照组相比较,ACO染毒组、G(o|¨) 6976组、AAP组、AAP+ACO组、AAP+G(o|¨) 6976联合处理组总PKCα绿色荧光信号差异无显著性。 标记P-PKCα(Ser-657)的Rhodamine呈红色荧光信号,弥散性分布于心肌细胞胞浆中。与正常对照组相比较,ACO染毒组、G(o|¨) 6976组,红色荧光信号显著减弱,有极显著性差异(P<0.01);而AAP组、AAP+ACO组、AAP+G(o|¨) 6976联合处理组红色荧光信号较正常对照组,也有极显著性差异(P<0.01)。 4.5乌头碱对大鼠心肌培养细胞Ca~(2+)调控蛋白表达的影响 多重荧光复合RT-PCR检测发现,与正常对照组比较,乌头碱染毒组RyR_2、NCX基因mRNA表达增加,而PLB、SERCA_2基因mRNA表达减少。 4.6乌头碱中毒尸检资料分析 病理变化特征主要为: ①心肌灶性出血,细胞横纹不清,肌浆凝聚,细胞间质淤血; ②肝可见肝细胞灶性或点状坏死,可见肝细胞脂肪变性或水样变性; ③肺脏可有灶性或点状出血,灶性肺水肿; ④可见部分胃粘膜有散在性点状出血; ⑤偶见肾组织点状出血和散在性坏死。 5研究结论 5.1优化、规范心肌细胞培养方法,建立稳定的体外新生大鼠培养细胞的乌头碱染毒模式,为法医毒理学研究提供了方法学上的参考。 5.2乌头碱染毒可引起心肌细胞DNA损伤,并呈明显的剂量—效应关系,推测细胞DNA损伤参与乌头碱毒性作用机制。 5.3乌头碱染毒可影响PKCα本身的磷酸化状态,同时乌头碱染毒所致的PKCα(Ser657)位点蛋白磷酸化表达下降,可进一步导致心肌细胞Cx43磷酸化状态减弱。推测PKCα磷酸化、Cx43磷酸化状态的改变是乌头碱心肌细胞毒性作用机制之一。 5.4乌头碱可影响心肌细胞Ca~(2+)调控蛋白的表达,使RyR_2、NCX基因mRNA表达增加,PLB、SERCA_2基因mRNA表达减少,推测Ca~(2+)调控蛋白参与了乌头碱毒性作用机制。其毒性作用机制的方式仍有待进一步研究。。Ca~(2+)调控蛋白参与毒性作用机制有待进一步研究。 5.5对10例乌头碱中毒尸检资料进行分析,总结其毒理病理变化特点,并提出乌头碱中毒法医学鉴定的注意事项。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:D919

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10 鲁翌;邻苯二甲酸酯类化合物好氧生物降解的实验研究[D];华中科技大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王晶;龙牙楤木叶总皂甙对肿瘤细胞凋亡及p53基因表达影响的实验研究[D];黑龙江中医药大学;2004年
2 罗明志;单细胞凝胶电泳[D];陕西师范大学;2005年
3 王桂玲;附子有效成分分离鉴定及药理作用研究[D];延边大学;2005年
4 周静波;乌头类有毒中药煎煮过程中物质基础的系统研究[D];成都中医药大学;2006年
5 代敏;保鲜乳挥发性风味物质的分析与调控[D];东北农业大学;2006年
6 王衍堂;生草乌水提液心脏毒性体内外试验研究[D];四川大学;2007年
7 李春丽;鹿肉发酵香肠发酵特性及工艺优化研究[D];吉林大学;2008年
8 王畏畏;香肠发酵剂筛选及其在发酵香肠中的应用研究[D];扬州大学;2008年
9 刘旭辉;实验室小型好氧堆肥反应器污染物去除研究[D];西安建筑科技大学;2008年
10 俞晓辉;发酵豆粕对断奶仔猪生长性能和肠道微生物的影响[D];南京农业大学;2008年
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 饶冉;;乌头属药用植物研究进展[J];安徽农业科学;2012年29期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 谭鹏;乌头碱型生物碱的模拟炮制研究[D];北京中医药大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 王红萍;猪肉膻味物质粪臭素的加工降解研究[D];西南大学;2012年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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2 张丽,李晔;乌头碱中毒致精神障碍2例[J];包头医学院学报;2002年03期
3 高岭;张学明;姚青;曹秀琴;;甘草酸二伪麻黄碱盐解热及对大鼠心率血压的影响[J];中华中医药杂志;2007年11期
4 孙建忠;乌头草中毒症的诊治[J];草与畜杂志;1998年03期
5 俞超芹,凌昌全,潘瑞萍,黄雪强,张登海;大蒜素诱导卵巢癌细胞株OVCA-3凋亡[J];第二军医大学学报;1999年05期
6 沈静,谢苗荣,徐雍,卢炎,沈潞华;乳鼠心肌细胞培养及纯化方法的改良[J];中国医药导刊;2001年03期
7 董丰,龚开政,张振刚,王波,吕申;原代心肌细胞培养方法的探讨[J];大连医科大学学报;2001年04期
8 王涛,余志斌,谢满江,车红磊;新生大鼠心肌细胞培养技巧[J];第四军医大学学报;2003年02期
9 车红磊,余志斌,谢满江;心肌细胞面积与其活力缺乏相关关系[J];第四军医大学学报;2004年11期
10 陈建萍,谭红梅,吴伟康,罗汉川,梁天文,黄河清,赵湘茹;四逆汤方药对缺血心肌的影响[J];第一军医大学学报;1999年02期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 赵昕;脱氢紫堇碱对培养心肌细胞内钙调控的作用机制的研究[D];中国医科大学;2004年
2 孟琼华;乌头碱对心肌细胞毒作用机制的研究[D];成都中医药大学;2006年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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3 宋娟;逄丽红;;乌头碱诱发心律失常后心脏M_3受体含量的变化[J];齐齐哈尔医学院学报;2007年11期
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5 张丽华;兰云殿;李利华;;草乌中毒死亡1例[J];法医学杂志;2009年04期
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7 秦景新;唐嘉;廖传新;蒙晓辉;;一起误服乌头碱药酒致2人中毒死亡的调查[J];职业与健康;2009年08期
8 高学昌,吴青民,刘思栋;生川乌及草乌中毒死亡1例[J];中国乡村医药;1999年04期
9 霍明章,于德洁,郝维,陈孟勤,曹济民;犬陈旧性心肌梗死时连接蛋白43的分布[J];中国医学科学院学报;2001年03期
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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2 郭巍;戴伶俐;李雪峰;闫妍;王英原;周建华;相文华;;马流感病毒多重RT-PCR检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
3 明艳林;郑国华;陈良华;吴琦;苏勇波;;二温式RT-PCR快速检测兰花斑点病毒技术的研究[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
4 王忠发;顾松叶;施慧;沈飚;;快速荧光定量RT-PCR定量检测对虾Taura综合症病毒(TSV)的方法建立与应用[A];2011年浙江省医学会医学病毒学分会、医学微生物与免疫学分会学术年会论文汇编[C];2011年
5 黄朝旭;;250例中毒死亡案例分析[A];第五次全国法医学术交流会论文集[C];1996年
6 南松剑;沈志强;刘吉山;陈继春;;山东省猪繁殖与呼吸综合征的RT-PCR检测与分析[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
7 栾婧婧;高运东;仲跻峰;赵宏坤;;半巢式RT-PCR快速检测犊牛轮状病毒方法的建立[A];第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会论文集(下)[C];2005年
8 孔繁德;王荣;陈琼;吴德峰;徐淑菲;;多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
9 曾伟伟;王庆;王英英;张乐生;刘宝芹;石存斌;吴淑勤;;草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法的建立及其初步应用[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
10 战勇;喻德跃;;大豆花叶病毒的组织印迹与RT-PCR检测[A];江苏省遗传学会第八届会员代表大会暨学术研讨会论文集[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 彭晓晴 通讯员 何梅明 梁飞恒;房客中毒身亡 业主和出租方赔偿[N];法治快报;2007年
2 记者 张昊;去年第四季度全国食物中毒死亡18人[N];健康报;2011年
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4 张胜利李亚男;男子酒精中毒死亡 酒友被判补偿五万[N];人民法院报;2007年
5 记者 王 鑫 通讯员 黄晓龙;焚烧香蜡纸钱致房客中毒死亡[N];人民法院报;2005年
6 本报记者 王孝弟;浙江危化品安全生产再敲警钟[N];中国化工报;2010年
7 陈文贵;中草药中毒会有哪些表现?[N];大众卫生报;2005年
8 记者  聂敏宁 通讯员  戚小虎;复核挖出“漏网之鱼”[N];人民法院报;2006年
9 本报记者  曲昌荣 曹树林 鲍丹;黄河滩湿地保护凸显尴尬[N];人民日报;2006年
10 胡文华;2007年全国因食物中毒死亡258人[N];中国医药报;2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘艳;乌头碱对大鼠心肌细胞毒性作用的分子毒理学机制研究[D];华中科技大学;2009年
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6 蔡正旭;由CX32和CX43组成的缝隙连接在癫痫发病中的作用及调控机制的实验研究[D];吉林大学;2004年
7 刘雪强;乌头碱逆转耐药性人口腔上皮鳞状癌细胞分子机制研究[D];北京中医药大学;2005年
8 李江;角蛋白降解菌Streptomyces fradiae var.k-11中蛋白酶基因的克隆及表达[D];中国农业科学院;2005年
9 翟小龙;EZH2基因与上皮性卵巢癌相关性的研究[D];四川大学;2004年
10 孟琼华;乌头碱对心肌细胞毒作用机制的研究[D];成都中医药大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 马腾;难治性癫痫患者外周血中MRP1表达的研究[D];青岛大学;2005年
2 冯旺琴;SLP-2基因在子宫内膜癌组织中的表达及其功能研究[D];青岛大学;2005年
3 段红军;人类p73基因TAp73αcDNA片段扩增及鉴定[D];江西医学院;2005年
4 张立成;AEV结构蛋白基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达[D];西北农林科技大学;2003年
5 陈泠;Tritordeum花粉特异性启动子的克隆与研究[D];华中科技大学;2005年
6 王世振;核因子-κB及ICAM-1mRNA在变应性鼻炎鼻粘膜中的表达及意义[D];山东大学;2006年
7 丁林灿;涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-2和ACC-M基因差异表达的初步研究[D];福建医科大学;2006年
8 谭伟成;新城疫病毒玉林株的分离鉴定与油乳剂灭活疫苗的研制[D];南京农业大学;2007年
9 鲁晓娟;黑曲霉A-25产木聚糖酶的变温发酵研究[D];河南农业大学;2007年
10 李芸;P2Y_2受体mRNA在慢性神经痛大鼠背根神经节表达的研究[D];华中科技大学;2007年
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