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《华中科技大学》 2009年
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雄性小鼠睾丸支持细胞中Attractin的功能研究

李洁  
【摘要】: 第一部分Atrn基因功能缺失雄性小鼠生殖系统表型分析 目的:观察Atrn基因功能缺失雄性小鼠生殖系统表型,为研究Atrn基因在雄性生殖系统中的作用提供实验依据。 方法:以C3HeB/FeJ种系Atrn基因缺失小鼠(Atrn~(mg-3J))为实验组,同种系野生型小鼠为对照组,通过观察不同年龄段(3月龄和5月龄)Atrn基因缺失小鼠和对照组小鼠睾丸和附睾重量、形态学改变、附睾尾精子密度和活动率,并用分光光度法检测4组小鼠睾丸组织酶乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)水平,并通过与同种系野生型雌鼠交配进行交配试验和体外受精试验,评估Atrn~(mg-3J)雄鼠的生育能力。 结果:与相同月龄对照组小鼠相比,3月龄Atrn基因缺失小鼠SDH比活性降低(P<0.05),其他指标无明显改变。5月龄Atrn基因缺失小鼠睾丸组织切片HE染色,精曲小管结构破坏;睾丸重量下降(P<0.05);附睾尾精子密度和活动率下降(P<0.05),LDH活性和SDH比活性降低(P<0.05);雌鼠与5月龄Atrn基因缺失雄鼠交配后可观察到阴道栓,但每只雌鼠平均胎仔数减少(P<0.05);体外受精试验结果显示Atrn基因缺失小鼠附睾精子与正常卵子受精率下降(P<0.05)。 结论:研究结果显示随着月龄的增加,Atrn基因缺失使雄性小鼠生殖系统发生退行性改变,表现为睾丸精曲小管结构改变和精子功能受损,这可能是导致Atrn基因缺失雄性小鼠生殖力下降的主要原因之一。然而受孕是一个复杂的生理过程,涉及多个因素的影响,本研究为进一步深入探讨Atrn基因在雄性生殖系统的生理作用机制奠定研究方向和实验基础。 第二部分干扰Atrn表达的小鼠睾丸支持细胞株的建立 目的:通过基因转染和RNA干扰技术,使小鼠睾丸支持细胞中内源性Atrn表达受到抑制,进一步研究Atrn在睾丸支持细胞中的作用。 方法:本实验采用Q-PCR、Western blot以及免疫荧光方法检测小鼠睾丸支持细胞株TM4细胞中Atrn mRNA和蛋白的表达。针对Atrn的编码序列中3段siRNA靶序列设计相应DNA序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。将重组载体在阳离子脂质体Lipofectamine~(TM)2000介导下瞬时转染TM4细胞,以转染试剂组(liposome)、阴性对照组(psiRNA-hH1)、空白对照组(未转染的TM4细胞)通过Q-PCR和Western blot法检测转染第3天Atrn mRNA、蛋白表达水平,确定有效序列,用含有该序列的重组载体稳定转染细胞,G418筛选,建立稳定干扰Atrn表达的睾丸支持细胞株,并用Q-PCR和ELISA分别对其分泌产物抑制素α(Inhα)mRNA和细胞培养液中的抑制素B(Inb B)的表达进行了检测,以探讨在细胞水平抑制内源性Atrn的表达对支持细胞功能的影响。 结果:小鼠睾丸支持细胞株TM4细胞表达Atrn mRNA和蛋白。构建重组载体psiAtrn-770、psiAtrn-2273、psiAtrn-2908,酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。将重组载体瞬时转染TM4细胞,转染后72h,以psiAtrn-2273和psiAtrn-2908转染组抑制Atrn mRNA和蛋白表达效果明显(P<0.05);psiAtrn-2273与psiAtrn-2908转染组之间相比,psiAtrn-2273转染组ATRN蛋白表达水平更低(P<0.05)。转染试剂组,阴性对照组与空白对照组相比,Atrn mRNA和蛋白表达差异无统计学显著意义(P>0.05)。质粒psiAtrn-2273能有效地阻断支持细胞内源性基因的表达,以质粒psiAtrn-2273稳定转染TM4细胞获得稳定干扰Atrn表达的TM4细胞株psiAtrn-TM4,以空质粒psiRNA-hH1稳定转染后得到的细胞株psiRNA-TM4为后续实验对照,psiAtrn-TM4细胞中Atrn mRNA表达抑制率约为80.1%,蛋白表达抑制率约为72.98%。当Atrn表达受到抑制的时候,InhαmRNA和细胞培养液中的Inb B与对照组细胞相比分别上升了约34.01%和17.9%,差异有统计学显著性意义(P<0.05)。 结论:本部分实验成功构建针对Atrn基因的特异性真核表达载体,建立了稳定干扰Atrn表达的TM4细胞株,有效地降低了支持细胞Atrn基因的表达。当内源性AtrnmRNA表达受到抑制时,小鼠睾丸支持细胞分泌产物抑制素表达水平升高。 第三部分应用蛋白组学技术分离鉴定睾丸支持细胞中ATRN功能相关的蛋白质 目的:通过蛋白组学技术分离鉴定小鼠睾丸支持细胞中Atrn基因部分缺失和完全缺失情况下差异性表达的蛋白质,为进一步研究Atrn在小鼠睾丸支持细胞中的功能提供科学依据。 方法:酶消化法原代培养小鼠睾丸支持细胞,并通过Feulgen染色、Hoechst染色、吖啶橙染色鉴定细胞纯度。以空质粒psiRNA-hH1稳定转染后得到的细胞株(psiRNA-TM4)为实验对照,采用双向凝胶电泳技术分离(two-dimensional gelelectrophoresis,2-DE)、基质辅助激光解析质谱(Matrix-assisted laserdesorption/icnization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)研究稳定干扰Atrn基因表达的小鼠睾丸支持细胞(psiAtrn-TM4),Atrn基因缺失小鼠原代睾丸支持细胞(mu-Sc)细胞中与Atrn缺失相关差异表达的蛋白质,并通过Q-PCR和Western Net对部分差异表达蛋白质mRNA和蛋白表达进行验证。 结果:实验分离的培养Atrn~(mg-3J)小鼠睾丸支持细胞,纯度达95%。采用2-DE与MALDI-TOF-MS联合分离鉴定psi-RNA-TM4,psi-Atrn-TM4,mu-Sc3组细胞中差异性表达的蛋白质,鉴定出主要的14个差异表达的蛋白质,其中有8种蛋白质包括ATPSYNTHASE,PEROXIREDOXIN 2,CU/ZN SUPEROXIDE DISMUTASE 1等在Atrn基因部分缺失细胞(psiAtrn-TM4)和完全缺失细胞(mu-Sc)中表达下调,6种蛋白质包括CASPASE6,KETOHEXOKINASE等上调,其中Sod1和caspase6 mRNA和蛋白在3组细胞中的的差异表达水平得到进一步验证。 结论:Atrn基因缺失导致相关蛋白质的差异性表达提示Atrn基因对睾丸支持细胞功能的影响是通过多途径实现的,包括抗氧化应激以及调控凋亡途径。为进一步深入研究Atrn在小鼠睾丸支持细胞中的功能和Atrn缺失导致小鼠睾丸退行性变的具体作用机制提供重要了依据和线索。
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R697

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【参考文献】
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